hello，情人節(jié)到了，大家感覺怎么樣？？？感覺很好的舉個手，讓大家羨慕一下，單身的也沒事，相互認識一下，我們以后讓別人羨慕，??。今天給大家分享10X單細胞空間解析腸道干細胞的生理調(diào)控，一旦涉及到組織有序性的調(diào)控分析，10X單細胞空間必須聯(lián)合才可以真正達到認識問題的目的，文章在A lymphatic-stem cell interactome regulates intestinal stem cell activity,可能是錯覺，感覺老外對待科研的態(tài)度要好的多~~~~
Summary
（Barrier epithelia）屏障上皮依賴于常駐干細胞進行體內(nèi)平衡、防御和修復。小腸和大腸的腸干細胞 (ISC) 對其局部微環(huán)境 (niche) 做出反應，以滿足對組織更新的持續(xù)需求，但它們的生態(tài)位的復雜性仍在研究中。在這里，分析報告了一個廣泛的淋巴網(wǎng)絡，它與這些生態(tài)位內(nèi)的 ISC 密切相關。這里設計了一種淋巴：類器官共培養(yǎng)系統(tǒng)，表明淋巴分泌因子在抑制早熟分化的同時維持 ISC。采用新的反卷積算法 BayesPrism 來配對單細胞和空間轉(zhuǎn)錄組學，以高分辨率繪制淋巴配體：ISC 受體相互作用。發(fā)現(xiàn)隱窩淋巴管是已知驅(qū)動 ISC 行為的 WNT 信號因子（WNT2、R-SPONDIN-3）的主要來源，而 REELIN 是隱窩淋巴管分泌的迄今為止未被重視的 ISC 調(diào)節(jié)劑。總之，研究將淋巴管作為控制 ISC 再生潛力的niche factors的中心樞紐。
Introduction
在我們的身體和外部環(huán)境的界面，屏障上皮細胞必須不斷地更新。 這些組織依賴于常駐組織干細胞，這些干細胞增殖以自我更新并補充上皮的分化后代。 在這些組織中，自我更新和分化必須緊密平衡和協(xié)調(diào)，以防止過度生長或再生和愈合不良。 為了調(diào)整它們的活動，干細胞駐留在niches（生態(tài)位）中，在那里它們與當?shù)氐奈h(huán)境進行交流，以接收調(diào)節(jié)其維持和分化的信號（再次強調(diào)生態(tài)位，也就是空間臨近通訊的重要作用）。
The multifariousness of stem cell niches of barrier epithelia is exemplified by the
intestine。小腸組織成重復的隱窩-絨毛單元，包括巨大的上皮表面積，是人體的主要吸收部位，而大腸則組織成重復的隱窩單元，大量定植有益細菌，是維生素和代謝物的關鍵部位合成。作為人體的主要吸收組織，小腸和大腸都受到動態(tài)和全身調(diào)節(jié)，這表明腸道干細胞 (ISC) 需要整合來自其生態(tài)位的線索并在組織范圍內(nèi)協(xié)調(diào)干細胞行為。然而，自從最初描述隱窩內(nèi)的 ISC 以來，很明顯這些生態(tài)位的成分和信號通路是多種多樣的。雖然據(jù)推測，參與 ISC 維持的關鍵信號，如 WNT 和 BMP 抑制劑，可能存在于沿著腸隱窩 - 絨毛軸的梯度以指導腸道分化，許多這些信號的性質(zhì)和來源仍然不完全清楚。同樣有待研究的是這些信號在小腸和研究較少的大腸之間可能有何不同，以及信號如何在隱窩之間協(xié)調(diào)以指導組織中的干細胞行為（單細胞空間技術強強聯(lián)合才能解決問題）。
成像技術和空間轉(zhuǎn)錄組學的改進提供了新的機會來繪制生態(tài)位圖并以比以往更高的分辨率識別動態(tài)響應的 3 維 (3D) 特征，例如脈管系統(tǒng)。這種深度 3 維成像提供了對組織干細胞如何對其微環(huán)境作出反應的見解，包括通過與血管和毛細淋巴管的相互作用。在小腸中，粘膜下淋巴脈管系統(tǒng)的乳毛細血管延伸進入吸收性腸絨毛并參與營養(yǎng)吸收和免疫監(jiān)視。盡管大腸缺乏乳管并且該組織中的淋巴結構特征不太清楚，但小腸和大腸中的粘膜下淋巴管改變是炎癥性腸病中腸組織炎癥的重要病理特征，炎癥性腸病是一種以炎癥和上皮細胞為特征的多因素疾病擾動?？紤]到這些組織中淋巴脈管系統(tǒng)的空間復雜性，淋巴管是否調(diào)節(jié)小腸上皮或大腸上皮的 ISC 仍未探索且難以解決。在這里，發(fā)現(xiàn)毛細淋巴管是小腸隱窩和大腸隱窩迄今為止未被重視的成分，并且我們表明它們是腸上皮分化的關鍵調(diào)節(jié)因子。采用全組織清除和 3D 成像，揭示了毛細淋巴管網(wǎng)絡與 ISC 所在的腸隱窩底部之間的密切聯(lián)系。通過設計淋巴管內(nèi)皮細胞 (LEC)：類器官共培養(yǎng)系統(tǒng)，我們在體外概括了這種關聯(lián)，并表明淋巴管分泌，即 LEC 分泌的因子會改變腸道類器官的形態(tài)發(fā)生和成熟。
為了描述推理的 LEC:ISC 串擾的性質(zhì)，對成年小鼠的小腸（充滿乳腺）和大腸（缺乏乳腺）進行單細胞 RNA 測序 (scRNA-seq) 和空間轉(zhuǎn)錄組學。設計一種新的計算方法，對這些低分辨率空間轉(zhuǎn)錄組譜進行反卷積，以重建不同腸細胞類型沿定型隱窩-絨毛和隱窩軸的空間關系。根據(jù)沿該軸的細胞位置分配細胞類型特異性轉(zhuǎn)錄組的能力能夠以高分辨率繪制這些組織的細胞和轉(zhuǎn)錄landscope。在這樣做的過程中，在隱窩底部確定了一個獨特的淋巴調(diào)節(jié)程序，該程序不同于絨毛內(nèi)的淋巴功能。通過將這些新發(fā)現(xiàn)的計算方法與功能query相結合，揭示了空間 ISC 受體-淋巴配體相互作用及其在調(diào)節(jié) ISC 行為和控制組織動力學中的功能重要性。
Results
Lymphatic capillaries neighbor stem cells at the intestinal crypt base
位于小腸上皮的袋狀隱窩內(nèi)的 ISC 的細胞生態(tài)位包括鄰近的特化上皮細胞（Paneth 細胞）、上皮下間充質(zhì)細胞（周圍成纖維細胞、肌成纖維細胞、基質(zhì)細胞、滋養(yǎng)細胞）和免疫細胞。 腸道干細胞身份喪失，因為committed的短壽命增殖后代繼續(xù)沿著隱窩-絨毛軸向上發(fā)育，然后根據(jù)其微環(huán)境、營養(yǎng)可用性和炎癥線索分化成不同的分泌和吸收譜系選擇之一。 在環(huán)境條件基本穩(wěn)定的正常體內(nèi)平衡中，單個隱窩內(nèi)的干細胞以基本穩(wěn)定的速率再生上皮細胞。
最近，發(fā)現(xiàn)淋巴毛細血管與毛囊干細胞 (HFSC) 緊密相關，它們在皮膚上同步毛發(fā)再生活動并控制單個毛囊niche的靜止。 然而，與經(jīng)歷長時間靜止的 HFSCs 相比，ISCs 不斷增殖，這讓我們想知道在腸道這種另一種上皮屏障組織中，毛細淋巴管是否仍然具有干細胞調(diào)節(jié)功能，如果是，如何進行調(diào)節(jié)。
由于像淋巴管這樣的血管網(wǎng)絡難以通過傳統(tǒng)的成像分析進行可視化，因此開始描述腸道干細胞生態(tài)位周圍的細胞多樣性，應用組織清除和整體成像，從而可以可視化 ISC 生態(tài)位的 3D landscope ，包括脈管系統(tǒng)的復雜結構。
對小腸的 3D 成像揭示了眾所周知的毛細血管叢，該毛細血管叢由血管網(wǎng)絡組成，該血管網(wǎng)絡沿著絨毛軸圍繞中央毛細淋巴管（乳管）。 然而，與乳突一樣突出但經(jīng)常被忽視的是位于隱窩下方的毛細淋巴管的豐富血管網(wǎng)絡。 淋巴標記 LYVE1 和 ISC 標記 LGR5+ 的共免疫熒光揭示了這些毛細淋巴管和 ISC 的有趣關聯(lián)，從一個隱窩底部跨越到另一個。
超微結構分析揭示了淋巴管和隱窩基底 ISC 之間的緊密物理接近，通常僅由一層薄薄的細胞外基質(zhì) (ECM) 隔開。 針對先前確定的隱窩間充質(zhì)細胞和免疫細胞的標記顯示，淋巴網(wǎng)絡與 ISC 生態(tài)位的成分交織在一起。 在某些情況下，發(fā)現(xiàn)毛細淋巴管突起與隱窩底部直接接觸。
淋巴乳管是腸道中營養(yǎng)吸收和免疫細胞運輸?shù)某墒焱緩?/strong>。 在絨毛中，乳腺通過血管網(wǎng)絡、免疫細胞和豐富的基質(zhì)細胞與上皮細胞分離。 相比之下，隱窩底部的毛細淋巴管與常駐上皮細胞密切相關，包括 Paneth 和 LGR5+ 干細胞和祖細胞。
鑒于小腸淋巴管在營養(yǎng)吸收中的關鍵功能，研究considered that lymphatic endothelial cell proximity to the crypt base might be merely a necessary component of their path from the lacteals to the collecting vessels which flow into mesenteric lymph nodes and ultimately deliver nutrients into the systemic circulation through the thoracic duct. 如果小腸中的淋巴：SC 接近只是乳酸聚集的結果，那么不會期望在大腸中觀察到這種情況，因為大腸的淋巴血管系統(tǒng)沒有乳酸，并且在營養(yǎng)吸收中起著名義上的作用。
結腸淋巴管，即大腸淋巴管，已知在腸道免疫監(jiān)視和調(diào)節(jié)中具有重要作用，但毛細血管網(wǎng)絡的結構尚未完全表征。 有趣的是，基于隱窩的 LGR5+ SCs 與整個腸道的毛細淋巴管有關。 雖然結腸 ISC 生態(tài)位缺乏Paneth細胞，但大腸中的大多數(shù) LGR5+ 隱窩至少部分位于毛細淋巴管上方，這讓人想起我們在小腸中觀察到的情況。
超微結構分析顯示，大腸中的 ISC 和毛細淋巴管之間存在類似的密切關系。 值得注意的是，淋巴-ISC 關聯(lián)在人類中也是保守的，在大腸活檢標本中發(fā)現(xiàn)了與隱窩上皮細胞相關的淋巴毛細血管。當之前對毛囊淋巴毛細血管網(wǎng)絡的發(fā)現(xiàn)結合起來時，這些數(shù)據(jù)表明，無論干細胞是靜止的（毛囊）還是快速循環(huán)的（大腸和小腸），毛細淋巴管都可以與上皮干細胞niche形成錯綜復雜的關聯(lián)。 這些新發(fā)現(xiàn)提出了一個問題，即這種近距離接觸是否有共同目的以及淋巴管在組織維持中的作用。 因此，研究試圖定義和描述毛細淋巴管對 ISC 行為的表型影響。
Lymphatic endothelial cells instruct intestinal organoid development and maturation（淋巴內(nèi)皮細胞有助于腸道類器官的發(fā)育和成熟）
為了測試淋巴內(nèi)皮細胞是否直接向腸上皮發(fā)出信號，利用培養(yǎng)小腸上皮干細胞的能力來生成 3D“小腸”類器官，并建立了一個與原代小鼠 LEC 共培養(yǎng)類器官的系統(tǒng)。該系統(tǒng)概括了在體內(nèi)觀察到的淋巴管內(nèi)皮細胞和小腸干細胞之間的聯(lián)系，能夠區(qū)分由于直接的細胞間通訊而產(chǎn)生的效應和由在該共培養(yǎng)系統(tǒng)中不存在的淋巴引流特性引起的效應。在共培養(yǎng)條件下（50% 常規(guī)類器官培養(yǎng)基：50% LEC 培養(yǎng)基），LEC 保持關鍵淋巴轉(zhuǎn)錄因子和蛋白質(zhì)標志物（PROX1、CD31 和 LYVE1）的表達，以及在該培養(yǎng)基中在 Matrigel 上培養(yǎng)時形成內(nèi)皮管的能力。同樣，在共培養(yǎng)基中單獨生長的類器官也保持了關鍵特征，包括形成隱窩結構域的能力。
與單獨培養(yǎng)的隱窩相比，與淋巴內(nèi)皮管一起培養(yǎng)的 ISC 或分離的隱窩產(chǎn)生的類器官具有顯著的形態(tài)變化。 在存在 LEC 的情況下形成的類器官尺寸更小，形狀更圓形，并且包含更少的隱窩結構域，表明成熟受損。 然而，重要的是，這些類器官展示了產(chǎn)生溶菌酶的Paneth細胞，這是小腸隱窩的關鍵成分，對 ISC 維持至關重要。 這一點，以及在存在 LEC 的情況下類器官形成的維持能力，表明毛細淋巴管本身并沒有損害類器官的形成。 相反，LEC 的存在似乎阻止了它們的成熟。 當 ISCs 與血管內(nèi)皮細胞 (BECs) 共培養(yǎng)時，沒有觀察到這種效應，強調(diào)了淋巴管內(nèi)皮在抑制隱窩分化方面的特異性。
為了進一步了解這些效應的性質(zhì)，對來自 LEC 共培養(yǎng)的類器官進行了單細胞 RNA 測序 (scRNA-seq)，并將它們與從在相同培養(yǎng)基中生長的標準類器官培養(yǎng)物中獲得的 scRNA-seq profile進行了比較。這里匯集了兩種培養(yǎng)條件下的細胞并進行了聚類。細胞類型獨立于培養(yǎng)條件聚集并分成 11 個clusters。明確指定了兩個表達 Goblet/Paneth 細胞（例如 Lyz1、Muc2）和腸內(nèi)分泌（例如 Chga、Chgb）標記物的clusters。此外，表達干細胞/祖細胞和轉(zhuǎn)運擴增 (TA) 細胞（例如 Olfm4、Ascl2、Tubb5、Top2a）的標記的四個clusters被標記為干細胞/TA。最后，五個clusters表達腸細胞標志物，如Alpi和Fabp1，并與沿著絨毛帶位置軸的腸細胞分化程序相關；將它們相應地標記為bottom-like 1、bottom-like 2、mid-like 1、mid-like 2、top-like。
在存在 LEC 的情況下生長的類器官顯示出顯著較少的終末分化腸細胞，盡管干細胞和祖細胞的比例相似。 這些發(fā)現(xiàn)也與基于最近鄰圖的差異豐度分析 (Milo) 一致，這提供了更精細的分辨率。 該分析產(chǎn)生了進一步的見解，揭示了在 LEC 存在下生長的類器官顯示出干/祖細胞clusters內(nèi)細胞分布的改變和腸上皮祖細胞的傾斜，而犧牲了完全（終末）分化的腸上皮細胞。
LEC 共培養(yǎng)的類器官在與活躍循環(huán) (Mki67+) 細胞相對應的細胞部分中的代表性也不足。 與活躍循環(huán)的腸道干/祖細胞數(shù)量減少一致，在 LEC 存在下生長的類器官中，10 分鐘脈沖期間 5-乙炔基-20-脫氧尿苷 (EdU) 的摻入減少。 與腸細胞終末分化阻滯一致的是成熟腸細胞標志物醛縮酶 B (ALDOB) 的免疫熒光減弱。 此外，在轉(zhuǎn)錄組水平上，與定義top區(qū)域的基因相比，來自共培養(yǎng)條件的腸細胞上調(diào)了定義底部區(qū)域的基因。
為了更好地理解兩種條件之間成熟度的差異，對分化軌跡進行了計算建模并量化了可能的分化路徑。 從對照類器官中獲得的腸細胞在最終分化的頂部區(qū)域內(nèi)更頻繁，而從 LEC 共培養(yǎng)的類器官中獲得的腸細胞更均勻地分布在中間狀態(tài)。 總之，這些數(shù)據(jù)支持一個模型，即隱窩底部的淋巴管內(nèi)皮細胞維持干細胞和祖細胞，但限制它們分化為成熟的腸上皮細胞。
The lymphatic secretome maintains ISCs but restricts their terminal differentiation(淋巴分泌組維持 ISC，但限制其終末分化)
如果正如迄今為止的研究預測的那樣，隱窩淋巴管通過支持維持腸干細胞和祖細胞而不是快速循環(huán)和終末分化的細胞來發(fā)揮作用，那么淋巴管內(nèi)皮細胞應該提高從初級類器官分離的單個細胞形成二級類器官的效率。 此外，如果隱窩淋巴管也能防止 ISC 終末分化為成熟的腸細胞，那么與在相同培養(yǎng)基中但沒有 LEC 的情況下形成的二級有機體相比，該測定中出現(xiàn)的有機體的大小應該減少。
為了檢驗這些假設，首先評估了 LEC 支持類器官生長的能力。 事實上，LEC 的存在使單個 ISC 的類器官形成效率增加了一倍以上。 與隱窩衍生的類器官類似，在 LEC 存在下生長的單細胞衍生類器官更小，突起更少。 正如預測的那樣，LEC 共培養(yǎng)的類器官也表現(xiàn)出降低的 ALDOB 免疫熒光，這與腸細胞生成受阻一致。
并非所有類器官都與 LEC 接觸，但大多數(shù)類器官仍顯示出尺寸減小和差異化。 同樣，許多但不是所有的隱窩在體內(nèi)顯示出與毛細淋巴管密切相關，即使它們這樣做了，LGR5+ 干細胞和 LEC 之間的直接細胞間接觸似乎也非常罕見。 因此，推斷 LEC 分泌的（淋巴管分泌）因子可能是在共培養(yǎng)類器官中觀察到的表型的原因。 為了驗證這一假設，收集了 LEC 條件培養(yǎng)基，并檢查了它在沒有 LEC 本身的情況下影響類器官起始和成熟的潛力。 LEC 條件培養(yǎng)基概括了 LEC 共培養(yǎng)的類器官的表型，顯示出較小的類器官和較少分化的后代。
接下來，從在 LEC 條件培養(yǎng)基中生長的類器官中分離出單個細胞，然后將它們置于沒有 LEC 的正常類器官培養(yǎng)條件下，出現(xiàn)了兩個重要的發(fā)現(xiàn)。 首先，LEC 條件培養(yǎng)基在這些二次試驗中提高了 LEC 條件 ISC 祖細胞的類器官群落形成效率，從而強調(diào)了淋巴管分泌因子對 ISC 維持的有效和直接影響。 其次，一旦淋巴管分泌因子不再存在，由這些預處理的 ISC 形成的類器官就會正常分化，這表明 LEC 損害 ISC 分化的作用是可逆的，并且取決于持續(xù)暴露于這些淋巴管分泌因子。 在組織的背景下，這種影響應該主要表現(xiàn)在隱窩生態(tài)位內(nèi)，干細胞和淋巴管所在的地方以及它們的分化受到抑制的地方。
The in vivo spatial map of cell types in the small and large intestines
接下來轉(zhuǎn)向解決隱窩淋巴管分泌因子的性質(zhì)，并揭示它們?nèi)绾斡绊戵w內(nèi)腸道干細胞。 由于乳淋巴管可能產(chǎn)生與位于隱窩底部的淋巴管完全不同的一組因子，因此有意義的結果需要空間轉(zhuǎn)錄組學方法。 因此，試圖通過計算整合 scRNA-seq 和空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，沿隱窩絨毛軸（小腸）和隱窩軸（大腸）的空間維度繪制腸細胞類型及其基因表達譜。 這種方法能夠（1）識別由 LEC 高度和/或獨特表達的基因，以及（2）將 LEC 基因表達模式與腸上皮內(nèi)淋巴管和 ISC（或其他潛在接收細胞）之間的空間接近度相關聯(lián)。
這里收集了來自小腸和大腸的腸細胞的綜合 scRNA-seq 譜，涵蓋了腸道內(nèi)免疫、基質(zhì)和上皮譜系的主要細胞類型，同時含有了稀有的 LEC 和 LGR5+ ISC populations。 小腸和大腸的免疫細胞各自包含主要的淋巴（T細胞、B細胞、漿細胞和生發(fā)中心B細胞）和骨髓（巨噬細胞、樹突細胞、單核細胞和粒細胞）細胞群。 類似地，基質(zhì)細胞根據(jù)膠質(zhì)細胞（例如 S100b、Gfap）、血液內(nèi)皮細胞（例如 Cd31、Cdh5）和淋巴管內(nèi)皮細胞（例如 Lyve1、Prox1）、肌成纖維細胞（例如 Acta2、Myh11）和成纖維細胞（例如 Col6a2、Dpt）標記基因聚集 . 聚類進一步揭示了間充質(zhì)細胞群的異質(zhì)性，如由滋養(yǎng)細胞（例如 Cd81）、遠程細胞（例如 Foxl1）和隱窩基質(zhì)細胞（例如 Cd34、Pdpn）的標記所定義的。最后，小腸和大腸的上皮細胞反映了所有主要的分化譜系，如腸上皮細胞（例如 Alpi、Fabp1）、杯狀細胞（例如 Muc2）、腸內(nèi)分泌細胞（例如 Chga、Chgb）、簇狀細胞（例如Dclk1）和Paneth細胞（例如 Lyz1、Defa17），后者在大腸中不存在。杯狀細胞表現(xiàn)出高度的異質(zhì)性，占大腸上皮細胞的很大比例。未成熟的上皮細胞分離成分泌前體（例如 Atoh1、Dll1）、轉(zhuǎn)運放大細胞（例如 Stmn1、Tubb5）和 Lgr5+ 祖細胞。在兩個 scRNA-seq 數(shù)據(jù)集中都發(fā)現(xiàn)了由 Lgr5 和 Olfm4 標記的真正 ISC。
雖然這些早期群體僅占小腸總隱窩上皮細胞的 4-6%，但富集策略能夠?qū)?LGR5+ 干/祖細胞的數(shù)量增加到總群體的約 30%，提供這些稀有種群的深層分子特征。 總之，這些數(shù)據(jù)構成了前所未有的小鼠結腸上皮綜合圖譜，以及小鼠小腸和大腸細胞群特別是 ISC 的寶貴轉(zhuǎn)錄組資源。
深入挖掘，接下來對匹配的組織樣本進行空間轉(zhuǎn)錄組學（10X Visium 平臺），這些樣本針對上皮細胞 (EpCAM)、ISC (OLFM4) 和 LEC (LYVE1) 進行了免疫標記。 用于空間轉(zhuǎn)錄組學 (10X Visium) 的商用平臺是一種有價值的工具，但分辨率有限，每個條形碼點（直徑約 50 微米，中心距為 100 微米的點）通常包含多種細胞和細胞類型。 這種限制排除了相鄰細胞之間相互作用的表征。 這對我們的興趣尤其成問題，即剖析 ISC 與其niche components之間的相互作用，因為這些細胞類型通常組合在一個spot內(nèi)。 了解生態(tài)位中細胞類型之間相互作用的性質(zhì)需要對（1）每個spot內(nèi)的細胞類型和（2）每個細胞在給定空間位置表達的基因進行去卷積的方法。
為此，我們使用了 BayesPrism，這是一種貝葉斯統(tǒng)計模型，通過使用來自匹配組織的 scRNA-seq 參考作為先驗信息，聯(lián)合反卷積每個空間點內(nèi)的細胞類型組成和細胞類型特異性基因表達譜。 該方法在bulk RNA-seq 反卷積中明顯優(yōu)于其他基于回歸的工具，并且其對平臺批次效應、技術偽影和噪聲的穩(wěn)健性使其特別適合空間反卷積，將每個 Visium 點視為批量 RNA 樣本。 此外，在 scRNA-seq 策略中對 LEC 和 LGR5+ ISC 的富集允許準確推斷腸素中這些稀有細胞類型。
通過將它們與沿隱窩絨毛或隱窩軸的預期細胞類型分布以及測序組織的免疫熒光圖譜進行比較來驗證我們的去卷積分配。 將 BayesPrism 與為空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)開發(fā)的其他反卷積工具進行基準比較，發(fā)現(xiàn) BayesPrism 與預期的標記基因表達模式具有最高的一致性（單細胞空間聯(lián)合分析）。
Cell type and expression cartography reveals in vivo lymphatic:ISC interactome
雖然 Visium 允許繪制基因表達的空間模式，但它在基因測量中的有限分辨率和稀疏性排除了我們詢問niche：ISC 相互作用所需的高分辨率空間基因表達圖。 為了構建能夠揭示細胞-細胞相互作用的隱窩-絨毛軸基因表達的高分辨率制圖，開發(fā)了 SpaceFold 軸投影。 為此，使用每個點的細胞類型分數(shù)的非線性降維來沿一維 (1D) 偽空間軸投影每個 Visium 點。
SpaceFold 利用了數(shù)百個高度刻板的腸上皮結構，每個結構都由小腸中重復的隱窩-絨毛單元或大腸中的隱窩單元組成。 盡管小腸和大腸之間存在固有差異，但各自組織內(nèi)的每個隱窩在大小和細胞類型沿隱窩-絨毛或隱窩軸的排序方面相似。 假設，隨著空間spot沿該定型軸隨機采樣，每個空間點的細胞類型組成，如 BayesPrism 所推斷的，將告知細胞沿一維人工隱窩絨毛 uni 的相對物理坐標。
事實上，SpaceFold 推斷的一維偽空間分別很好地概括了沿著小腸隱窩絨毛和大腸隱窩軸的預期細胞類型分布。吸收性腸細胞cluster沿絨毛軸映射，由絨毛區(qū)標記基因預測，底部和頂部區(qū)腸細胞落入各自的位置。有趣的是，投影軸將含有隱窩毛細淋巴管的spot與乳淋巴管區(qū)分開來，后者從基底毛細淋巴管床延伸到小腸中腸絨毛的尖端。值得注意的是，大腸數(shù)據(jù)集中不存在這種突起，這與該組織中不存在乳腺一致。重要的是，該圖還概括了 ISC 生態(tài)位細胞沿該軸的已知分布，含有滋養(yǎng)細胞的基質(zhì) 3 樣種群落在其預測的小腸和大腸隱窩底部下方的位置。
接下來繪制了每種細胞類型的基因表達譜?；诿總€空間spot中去卷積的細胞類型特異性基因表達譜，繪制了已建立的上皮細胞（例如 Lgr5 作為 ISC 的標志物，Defa5 作為潘氏細胞的標志物）和基質(zhì)（例如 Grem1 作為隱窩的標志物）的轉(zhuǎn)錄水平?；诨|(zhì)細胞/滋養(yǎng)細胞）沿投影的隱窩絨毛軸的每個點的標記基因。在標記基因表達與其相關細胞類型的預期空間分布之間發(fā)現(xiàn)了高度一致性。腸絨毛上皮細胞區(qū)標記物也可預測地沿投影絨毛軸分布?？傊?strong>通過準確地對細胞類型組成進行反卷積，推斷每個空間點內(nèi)的細胞類型特異性基因表達譜，并通過 SpaceFold 生成定型軸投影，能夠獲得細胞類型和細胞類型的高分辨率制圖-小腸和大腸中的特定基因表達譜，分別沿著隱窩絨毛和隱窩軸。盡管研究的重點是 LEC：隱窩生態(tài)位中的 ISC 相互作用，但數(shù)據(jù)和制圖為繪制腸道中其他細胞類型之間的相互作用提供了豐富的資源。
Lymphatic capillaries are a local source of stem cell niche factors
隨著小鼠腸道的去卷積空間轉(zhuǎn)錄組和淋巴衍生的分泌因子在體外調(diào)節(jié)類器官行為的知識，準備解開能夠在體內(nèi)向 ISC 發(fā)出信號的空間相關隱窩淋巴管生成配體。 從單細胞 RNA-seq 數(shù)據(jù)集中獲得在淋巴管內(nèi)皮細胞中顯著水平表達的基因（在超過 20% 的 LEC 中表達），但在相關的血液內(nèi)皮細胞中沒有（在不到 20% 的 BEC 中表達）。 根據(jù)這些，根據(jù)編碼預測分泌和細胞外定位的 N 端信號肽的序列的存在，生成了 12 個編碼蛋白質(zhì)的基因列表，這些蛋白質(zhì)很有可能被分泌到細胞外。
接下來檢查了這 12 個 LEC 衍生因子在隱窩生態(tài)位的不同細胞類型中的中值表達。排除了與 ISC 功能直接相關的可能性低的那些（例如那些編碼在抗菌肽或參與凝血級聯(lián)或銅代謝的蛋白質(zhì)中起作用的蛋白質(zhì)），以關注 5 個候選淋巴管分泌因子的列表。同時，使用高分辨率、細胞類型特異性、偽空間轉(zhuǎn)錄組制圖以細胞類型特異性方式繪制這些基因中的每一個沿隱窩-絨毛軸的空間表達。從這些分析中，了解到其中一些基因，例如。 Ntn1 和 Il33 在淋巴管中顯示富集但不是唯一的表達。相比之下，Reln、Ccl21a、Rspo3 和 Wnt2 在 LEC 中的表達高于其他生態(tài)位細胞，并且在隱窩底部的生態(tài)位淋巴管中富集。在這四個因子中，主要由基于隱窩的淋巴管內(nèi)皮細胞表達，三個具有由小腸和大腸中的 ISC 表達的受體，使其成為在隱窩生態(tài)位內(nèi)介導 LEC:ISC 信號傳導的 strong candidates。
由 Rspo3 編碼的 R-SPONDIN-3 與 LGR5 結合并增強腸干細胞中的 WNT 信號傳導。 雖然它最初被確定為間充質(zhì)細胞產(chǎn)生的一個因子，但最近報道 Rspo3 表達也由淋巴管表達。 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)清楚地證實了基于隱窩的淋巴管是這種重要的 ISC 配體的主要來源。 雖然 WNT2 尚未在隱窩淋巴管的背景下進行研究，但它已添加到由 Paneth 和小生境間充質(zhì)細胞表達的規(guī)范 WNT 列表中。 鑒于 WNT-Frizzled 信號在 ISC 維護中的重要性，這些因素在基于隱窩的 LEC 中的重要性提高了淋巴管作為 ISC niche的關鍵新組成部分的重要性。
雖然 R-SPONDINs 和 WNTs 在 ISC 功能中的作用已經(jīng)確立，但 REELIN 以前并未被描述為 ISC 生態(tài)位因子，而是作為參與神經(jīng)元遷移和心臟重塑的大型細胞外基質(zhì)蛋白。 鑒于 REELIN 的主要受體 Vldlr/Lrp8 和 Itgb1 均由 ISC 表達，而 Reln 由基于隱窩的淋巴管選擇性表達，因此它成為引發(fā) LEC 對 ISC 維持和分化影響的good candidate。
通過免疫熒光判斷，REELIN 在培養(yǎng)的 LEC 中表達，組織清除和整體成像證實了它在 LEC 中的豐富表達，這些 LEC 集中在小腸和大腸的隱窩基底毛細血管網(wǎng)絡中。 最引人注目的是，在標準類器官培養(yǎng)物中添加重組 REELIN 概括了與 LEC 共培養(yǎng)和/或在 LEC 條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)的類器官的表型，REELIN 處理的類器官表現(xiàn)出尺寸減小、圓形度增加和隱窩結構域數(shù)量減少。 這些數(shù)據(jù)強調(diào)了淋巴管生成分泌組在控制 ISC 行為和維持腸隱窩生態(tài)位干性方面的功能重要性和生理相關性。 此外，我們的研究闡明了整合轉(zhuǎn)錄組和高分辨率空間分析在剖析干細胞生態(tài)位的復雜性和識別新的生態(tài)位成分方面的力量。
Discussion
Lymphatics and the Intestinal Stem Cell Niche
已知 WNT 和 BMP 的逆梯度以及其他信號是由腸隱窩生態(tài)位的不同細胞成分產(chǎn)生的，以影響 ISC 的自我更新和健康和疾病的分化。然而，這些線索的綜合性質(zhì)以及它們?nèi)绾蝿討B(tài)協(xié)調(diào)以協(xié)調(diào)跨組織的干細胞行為仍未完全了解。之前發(fā)現(xiàn)淋巴毛囊為皮膚中的毛囊干細胞形成了一個動態(tài)的生態(tài)位，這些細胞經(jīng)歷周期性的靜止和再生活動以驅(qū)動毛發(fā)周期。與皮膚相比，腸道淋巴網(wǎng)絡的重點是乳管，它是由血管網(wǎng)絡包裹的中央毛細淋巴管，從腸黏膜下層延伸到絨毛，并具有運輸膳食脂質(zhì)和營養(yǎng)物質(zhì)、免疫監(jiān)視和流體平衡調(diào)節(jié)。盡管與小腸乳管相連，但整個腸道隱窩下方的毛細淋巴管網(wǎng)絡在很大程度上被忽略了。在這方面，3D 成像揭示并通過超微結構分析證實的 ISC 隱窩和淋巴管之間的密切關系既顯著又intriguing。
建立的淋巴器官共培養(yǎng)系統(tǒng)揭示了淋巴內(nèi)皮細胞對維持 ISC 的自我更新能力和適應性同時抑制其分化的有效作用。 將此特征追溯到淋巴管分泌的因子，因為 LEC 條件培養(yǎng)基足以引發(fā)類器官的這些表型變化。 重要的是，當預條件 ISC 在正常的類器官培養(yǎng)條件下生長時，與在正常培養(yǎng)基中培養(yǎng)的 ISC 相比，它們保留了優(yōu)越的組織再生活性。 然而，在條件培養(yǎng)基中去除 LEC 分泌因子后，這些 ISC 能夠沿著其分化譜系正常發(fā)展。
Lymphatics as a Signaling Hub for Tissue Stem Cells
沒有采用蛋白質(zhì)組學方法來識別所涉及的淋巴因子，而是設計了一種轉(zhuǎn)錄組策略來獲得candidates，然后可以對其進行功能性詢問。 BayesPrism 將 10X Visium 空間轉(zhuǎn)錄組學與scRNA-seq 數(shù)據(jù)整合在一起，不僅可以揭示細胞類型分數(shù)，還可以揭示每個spot的細胞類型特異性基因表達譜。利用基于 scRNA-seq 的參考圖譜通過新的 SpaceFold 方法對低分辨率空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行反卷積，通過計算重建了隱窩-絨毛單元的空間組織。該分析揭示了小腸和大腸內(nèi)每個細胞的高分辨率空間圖及其空間決定的基因程序。通過富集淋巴管內(nèi)皮細胞和稀有的 LGR5+ 祖細胞，這些圖譜變得更加有意義。這可以通過在腸隱窩-絨毛軸上剖析淋巴管內(nèi)皮網(wǎng)絡內(nèi)的轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性以及識別隱窩底部毛細淋巴管特異性產(chǎn)生的因子的能力來說明。
這一策略非常有效地指導我們找到直接指導 ISC 發(fā)育和成熟的獨特淋巴管分泌信號。 通過定位生態(tài)位信號和/或其 ISC 受體，一種機制浮出水面，即從其生態(tài)位信號中置換出來的 ISC 后代執(zhí)行分化程序。 當重新繁殖在 LEC 條件培養(yǎng)基中生長的類器官時，我們在體外的研究結果證實了這一點。 我們的制圖方法澄清了先前關于 Rspo3 主要來源的模糊性，編碼 LGR5+ ISC 的關鍵 WNT 增強生態(tài)位信號，并將 REELIN 確定為隱窩生態(tài)位內(nèi)向 ISC 發(fā)出信號的額外淋巴候選因子。 事實上，在類器官模型中，已知 RSPONDIN（RSPO-1 包含在我們的 ENR 類器官培養(yǎng)基中）對于 ISC 維持至關重要，正如展示的，REELIN 對類器官的發(fā)育和成熟也有直接而明顯的影響。
在重新審視 HFSC 生態(tài)位時，周圍的毛細淋巴管在干細胞維持和毛發(fā)再生中起關鍵作用，有趣的是，Reln（在 LECs 中）和 Lrp8/Vdlr/Itgb1（在 HFSCs 中）也被表達，這表明它的保守作用組織干細胞niche中的 REELIN 信號傳導。 此外，盡管腸道和皮膚中的干細胞活動和組織再生存在差異，但淋巴管的功能似乎相似，即通過控制干細胞生態(tài)位內(nèi)的維持和再生活動。 在這方面，有趣的是，盡管干細胞生態(tài)位具有一些保守的特征，正如我們在這里發(fā)現(xiàn)的那樣，但其他一些特征似乎是為適應每種組織的特定需求而量身定制的。
The Power and Universality of Our Computational Strategy in Unearthing Intercellular Interactions Within Tissues
雖然超出了當前研究的范圍，但在這里繪制的高分辨率空間圖以及相關的小腸和大腸細胞的深層單細胞分析現(xiàn)在提供了豐富的數(shù)據(jù)集，以query對空間定義的細胞類型和基因表達程序的更多見解以及腸道內(nèi)的細胞相互作用。雖然大多數(shù)先前的研究只關注從空間轉(zhuǎn)錄組學推斷細胞類型分數(shù)，但我們的研究強調(diào)了推斷空間分辨的細胞類型特異性基因表達的重要性。此外，該方法也可以應用于由空間有序單元組成的其他組織的空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。在這方面，BayesPrism 的兩個特點使其對其他空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集具有高度的泛化性：（1）它不依賴于在 scRNA-seq 數(shù)據(jù)中觀察到的細胞類型比例，使其對富含稀有細胞類型的數(shù)據(jù)集特別有效(2) 它對技術甚至生物學變異具有魯棒性，因此不需要通過 scRNA-seq 和空間轉(zhuǎn)錄組學分析的完美匹配的樣本。
利用刻板的隱窩絨毛和隱窩單位，SpaceFold 能夠?qū)⑽覀兊霓D(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)壓縮到一維空間軸上，從而促進我們對腸道中空間受限基因表達的分析。 SpaceFold 可以類似地應用于其他定型組織結構（例如毛囊），并且可以擴展以將每個點投影到二維上，以構建更復雜組織單元的 2D 制圖。
Broader Implications for Lymphatic-ISC Interactions: Looking Ahead.
盡管在這里專注于淋巴管內(nèi)皮細胞和 ISC 之間的直接通訊，但淋巴管也可能介導其他隱窩動力學，包括特定生態(tài)位信號分子的運輸、液體引流和免疫細胞與 ISC 的串擾。Indeed, while immune cells can directly signal to stem cells to orchestrate pathogen responses, immune-mediated damage of ISCs is a common feature of graft-versus-host disease, in which lymphoid organs are damaged, suggesting an important role for immune cell drainage from the niche via lymphatics.
由于淋巴管可以發(fā)揮的作用的多樣性，它們與 ISC 的關聯(lián)也可能對疾病狀態(tài)產(chǎn)生重要影響。 在這方面，腸炎性疾病與淋巴管擴張、黏膜下水腫、淋巴阻塞、淋巴結病、淋巴管擴張和淋巴管生成有關。 此外，肥胖會改變 LEC 的密度、增殖和滲透性。 淋巴管中的任何或所有這些擾動都可能直接影響 ISC。 為了指導未來的治療，重要的是詢問淋巴轉(zhuǎn)錄組在疾病狀態(tài)下是如何改變的，它如何解釋炎癥和代謝線索，以及它如何將它們傳遞給 ISC niche。
Method
scRNA-seq data analyses（我們來總結一下）
- remove ambient RNA molecules ---- CellBender
- removed low quality cells ---- i) genes detected in fewer than 3 cells, ii) cells with under 200 genes or 1000 UMIs, and iii) cells with a mitochondrial fraction above 15%.
- emove doublets ---- performance of both DoubletDetection and Scrublet 。
-
降維選擇的高變基因 ---- 5000
圖片.png - 軌跡推斷 ---- CellRank，CytoTRACE、Palantir。
BayesPrism algorithm（單細胞空間聯(lián)合算法）
生活很好，有你更好，大家情人節(jié)快樂~~~
