Seahorse能量代謝分析儀主要功能
1、采用超敏感的生物傳感器和非接觸式設(shè)計，真正實現(xiàn)檢測細(xì)胞零損傷；
2、實時檢測細(xì)胞線粒體、糖酵解的能量代謝情況，即時反應(yīng)細(xì)胞生理狀態(tài)；
3、同步檢測細(xì)胞的耗氧量和產(chǎn)酸率（pH值變化），數(shù)據(jù)結(jié)果更加全面；
4、實現(xiàn)同時檢測96個細(xì)胞樣品，通量高，速度快；
5、自動化控制檢測流程、自動化控制添加多達(dá)四種藥物，操作方便高效。
原 理
Seahorse XF 技術(shù)可測量微孔板細(xì)胞周圍培養(yǎng)基中的氧通量（即耗氧率，oxygen consumption rate，OCR）和質(zhì)子通量（即細(xì)胞外酸化率extracellular acidification rate，ECAR）。OCR 與線粒體呼吸成正比，而 ECAR 與糖酵解成正比。
1. 有氧呼吸（線粒體呼吸）
因為有氧呼吸是在第三階段（氧化磷酸化階段）才消耗氧分子，所以測定氧消耗速率反映的是有氧呼吸的水平以及潛力的變化。既然XF技術(shù)是實時檢測氧氣含量變化，那么我們肯定是需要細(xì)胞耗氧能力發(fā)生變化的，所以我們可以將呼吸鏈上的不同蛋白逐個抑制掉。
1.1 ATP合成酶抑制劑——Oligomycin（寡霉素）
ATP合成酶，即線粒體復(fù)合物V，是有氧呼吸最后一步釋放大量能量的關(guān)鍵分子，其活性若被抑制則有氧呼吸在最后一步（合成ATP）被終止，而前一階段（氧與質(zhì)子以及電子生成水）因下游“擁堵”導(dǎo)致耗氧停止(個人理解，若有誤，請大咖們批評更正)。下降的這部分為ATP production（這個概念很容易理解）或ATP-linked respiration（這個概念不是很好理解，我的疑問是這個概念似乎更應(yīng)該直接抑制complex IV，這樣可以直接終止其介導(dǎo)的耗氧反應(yīng)）。
▲線粒體膜上電子傳遞鏈以及測試過程中使用的四種藥物
1.2 線粒體解偶聯(lián)劑——FCCP
這里的解偶聯(lián)解的是氧化反應(yīng)和磷酸化反應(yīng)之間的偶聯(lián)，氧化反應(yīng)可以理解為電子的傳遞過程，這個過程中會總伴隨著自由能的釋放（即形成質(zhì)子梯度差），在ATP合成酶介導(dǎo)的最后一步反應(yīng)時，這些自由能轉(zhuǎn)化到了ATP中。FCCP可以通過減小質(zhì)子在線粒體內(nèi)膜兩側(cè)的梯度差，導(dǎo)致氧化反應(yīng)和磷酸化反應(yīng)不再偶聯(lián)，但復(fù)合物IV介導(dǎo)的耗氧反應(yīng)仍可繼續(xù)，氧消耗率繼續(xù)上升，線粒體膜間區(qū)域的質(zhì)子濃度繼續(xù)上升，直至達(dá)到上限。高出基礎(chǔ)耗氧的部分即為儲備有氧呼吸能力（reserve capacity）。
▲線粒體壓力測試圖譜
1.3 復(fù)合物 I 和 III （有氧呼吸）抑制劑——魚藤酮和抗霉素（rotenone & antimycin）
電子傳遞鏈的起點復(fù)合物 I 以及復(fù)合物 III 被抑制則整個氧化磷酸化（線粒體呼吸）過程被抑制，因此剩下的則是非線粒體驅(qū)動的耗氧。
看到這里，你是不是覺得，做了上述指標(biāo)的檢測跟我們標(biāo)題所說的糖酵解基本沒啥關(guān)系？
對的，可以說基本沒啥關(guān)系，但也可以順便測一下
。我們重點要做的糖酵解還得看下面的內(nèi)容！
2. 胞外酸化率（反映糖酵解總體功能）
葡萄糖經(jīng)酶促反應(yīng)生成丙酮酸這一過程為糖酵解，在此過程中，不需要消耗氧，所以跟前面的耗氧率沒有啥關(guān)系。在沒有線粒體的參與下，丙酮酸最終轉(zhuǎn)化為乳酸，排到細(xì)胞外。所以，我們通過另一個指標(biāo)來反映糖酵解——酸化率。
2.1 呼吸的起點——葡萄糖
加葡萄糖后開始第一步反應(yīng)，糖酵解，這很好理解。
2.2 ATP合成酶抑制劑——寡霉素（Oligomycin）
這里跟前面是一樣的作用，主要用來阻斷有氧呼吸最后一步。為什么不用魚藤酮、抗霉素抑制復(fù)合物I和III抑制有氧呼吸的開始，目前還不是很能理解。等我搞明白了，再來補充。
2.3 糖酵解抑制劑——2-DG
2-DG(2-脫氧葡萄糖)可與葡萄糖競爭性結(jié)合糖酵解途徑的己糖激酶（糖酵解第一個限速酶），因而抑制糖酵解。
▲糖酵解壓力測試圖譜（糖酵解功能關(guān)鍵參數(shù)）
3. 糖酵解質(zhì)子流出率（更進(jìn)一步表征糖酵解的實時變化）
除了檢測耗氧率和胞外酸化率，Seahorse XF技術(shù)還可以檢測質(zhì)子流出率（proton efflux rate，PER）。主要利用魚藤酮/抗霉素和2-DG來相應(yīng)地改變有氧呼吸和糖酵解的質(zhì)子流（如下圖）。
▲糖酵解速率檢測原理
▲安捷倫 Seahorse XFp 糖酵解速率測定圖譜。
活細(xì)胞的質(zhì)子外流包括糖酵解和線粒體源性酸化。線粒體酸化。通過線粒體功能的抑制作用。(Rot/AA) 對線粒體功能的抑制作用，可計算線粒體相關(guān)的酸化。將線粒體酸化減去總質(zhì)子流出率，得出糖酵解質(zhì)子流出率。
Agilent Seahorse XFp 糖酵解速率分析儀的原理。能量由細(xì)胞內(nèi)的兩種途徑產(chǎn)生--糖酵解和線粒體呼吸。在糖酵解過程中，葡萄糖分解為乳酸時，質(zhì)子被擠出到細(xì)胞外介質(zhì)中，XFp 分析儀檢測到的是 ECAR。此外，線粒體 TCA 活動會產(chǎn)生二氧化碳，使培養(yǎng)基水化和酸化。在檢測過程中使用復(fù)合體 I 和復(fù)合體 III 線粒體抑制劑（Rot/AA）抑制呼吸作用（OCR），可計算出呼吸作用的質(zhì)子外流率，并從總質(zhì)子外流率中去除，得出糖酵解質(zhì)子外流率（glycoPER）。為確認(rèn)途徑的特異性，注入糖酵解抑制劑 2-DG，以阻止糖酵解酸化。
更 多 背 景 知 識
一、有氧呼吸的三個階段
1. 糖酵解
葡萄糖在細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中分解為兩分子的丙酮酸，釋放少量能量：C6H12O6+酶→2丙酮酸（C3H4O3)+4[H]+能量（2ATP）。
2. TCA循環(huán)/檸檬酸循環(huán)
線粒體基質(zhì)中，兩分子的丙酮酸分解為CO2和少量能量：2丙酮酸（C3H4O3)+6H2O+酶→6CO2+20[H]+能量（2ATP）。包含乙酰CoA的形成這一準(zhǔn)備階段，乙酰CoA進(jìn)入線粒體內(nèi)參與的這個循環(huán)才是嚴(yán)格意義上的TCA循環(huán)階段。
3. 氧化磷酸化
這需要線粒體內(nèi)膜上的呼吸鏈的參與，又被稱為電子傳遞鏈（electron transport chain）磷酸化。線粒體內(nèi)膜上，ETC與氧結(jié)合，釋放大量能量：24[H]+6O2+酶→12H2O+能量（34ATP）。
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氧化磷酸化的工作原理是利用釋放能量的化學(xué)反應(yīng)來驅(qū)動需要能量的反應(yīng)：這樣的反應(yīng)稱為是偶聯(lián)反應(yīng)。電子在電子傳遞鏈上從電子供體（如NADH）到電子受體（如氧）的流動，是一個放能的過程，而ATP的合成是一個耗能的過程，需要輸入能量。電子傳遞鏈和ATP合酶都在膜中，在稱為“化學(xué)滲透”的過程中，通過質(zhì)子穿過這層膜的運動，將能量從電子傳遞鏈轉(zhuǎn)移到ATP合酶中。
前兩個階段獲得的ATP屬于底物水平的磷酸化（高能化合物通過酶促反應(yīng)使能量傳遞給ADP生成ATP），而氧化磷酸化是指電子在從被氧化(需氧)的底物傳遞到氧的過程中，釋放出來的自由能推動ADP生成ATP的過程。
呼吸鏈（即ETC）由四部分組成: 復(fù)合體I(NADH) 、復(fù)合體II(FADH2）、復(fù)合體III和復(fù)合體IV。除此之外，還需要泛醌（CoQ）和細(xì)胞色素C（CytC）參與電子的傳遞。傳遞順序如下 (從左到右) ：
圖1. 呼吸鏈【1】
由于線粒體內(nèi)膜的兩側(cè)的氫離子濃度存在高低梯度(內(nèi)側(cè)（膜間區(qū)域）濃度比外側(cè)（線粒體基質(zhì)區(qū)域）濃度大)，而位于內(nèi)膜上的ATP合成酶（復(fù)合物V），可以將氫離子通過F0的氫離子通道，使氫離子從高濃度的內(nèi)側(cè)回流到低濃度的外側(cè)，即回流到線粒體基質(zhì)中，而 F1通過氫離子回流的能量，驅(qū)動ADP生成ATP。
圖2. 呼吸鏈上全部復(fù)合物及其相應(yīng)功能【3】
二、名詞解釋
氧化磷酸化是一個生物化學(xué)過程，發(fā)生在真核細(xì)胞的線粒體內(nèi)膜或原核生物的細(xì)胞質(zhì)中，是物質(zhì)在體內(nèi)氧化時釋放的能量通過呼吸鏈供給ADP與無機磷酸合成ATP的偶聯(lián)反應(yīng)。
ATP合成酶，又稱FoF?-ATP酶在細(xì)胞內(nèi)催化能源物質(zhì)ATP的合成。在呼吸或光合作用過程中通過電子傳遞鏈釋放的能量先轉(zhuǎn)換為跨膜質(zhì)子(H+)梯度差（可想象為高水位的勢能），之后質(zhì)子流順質(zhì)子梯差通過ATP合酶驅(qū)動使ADP和磷酸鹽（Pi）合成ATP（類似水流帶動發(fā)電機發(fā)電）。合成一個ATP分子所需的質(zhì)子數(shù)估計為為3至4個。
解偶聯(lián)劑（uncoupler），指一類能抑制偶聯(lián)磷酸化的化合物。能使氧化與磷酸化脫離(即解偶聯(lián))，雖然氧化照常進(jìn)行，但因不能進(jìn)行磷酸化而不能生成ATP，使P/O比值降低，甚至為零。FCCP（全稱是Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone，同CCCP；酸性芳香族化合物）是一種有效的線粒體氧化磷酸化解偶聯(lián)劑 (IC50 = 20 nM)，是一種代謝毒素，通過跨線粒體內(nèi)膜運輸質(zhì)子（H+能夠直接通過線粒體內(nèi)膜擴(kuò)散，而無需通過ATP合成酶，見圖3右上角部分）來破壞 ATP 合成，使線粒體膜電位去極化。
圖3. 細(xì)胞呼吸過程【4】
糖酵解質(zhì)子流出率（glycolytic proton efflux rate，glycoPER)，糖酵解過程中源自糖酵解的質(zhì)子向細(xì)胞外介質(zhì)中排出的速率，不考慮CO2依賴性酸化的作用。這一測量結(jié)果與細(xì)胞外乳酸生成率高度相關(guān)。
質(zhì)子滲漏（proton leak）：質(zhì)子遷移到基質(zhì)中，但沒有產(chǎn)生 ATP，這使得底物氧和 ATP 的產(chǎn)生不能完全耦合。
有氧糖酵解，在正常生理情況下，細(xì)胞只在限氧條件下進(jìn)行糖酵解，而癌細(xì)胞即使在有氧條件下也傾向于進(jìn)行糖酵解；這被稱為沃伯格（Warburg）效應(yīng)或有氧糖酵解，是癌細(xì)胞與正常細(xì)胞的區(qū)別所在。
▲腫瘤細(xì)胞Warburg效應(yīng)與正常細(xì)胞的有氧呼吸代謝途徑的比較【6】
參考文獻(xiàn)
1. https://www.zhihu.com/question/416165432
2. https://zhuanlan.zhihu.com/p/629486604
3. https://istudy.pk/electron-transport-chain/
4. https://www.chegg.com/homework-help/questions-and-answers/refer-summary-diagram-cellular-respiration--fccp-metabolic-poison-allows-mathrm-h-diffuse--q122295525
5. https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/103346-400.pdf
6. Arora A, Singh S, Bhatt A N, et al. Interplay between metabolism and oncogenic process: role of microRNAs[J]. Translational oncogenomics, 2015, 7: 11.
