內(nèi)皮活性增強(qiáng)子的重構(gòu)與肺動(dòng)脈高壓中異?；蛘{(diào)控網(wǎng)絡(luò)相關(guān)
Remodeling of active endothelial enhancers is associated with aberrant gene-regulatory networks in pulmonary arterial hypertension
https://www.nature.com/articles/s41467-020-15463-x
?研究背景
?實(shí)驗(yàn)方法
?實(shí)驗(yàn)結(jié)果
?結(jié)論與討論
什么是肺動(dòng)脈高壓?
目前報(bào)道約15%肺動(dòng)脈高壓(PAH)患者為家族性。其中70%的人攜帶BMPR2基因突變。另外30%的散發(fā)性PAH病例也有BMPR2突變，統(tǒng)稱為遺傳性(H)PAH。還有一類不知道原因的，統(tǒng)稱為特發(fā)性(I)PAH。
患者癥狀表現(xiàn)為疲倦和呼吸急促，有時(shí)會(huì)持續(xù)數(shù)年，但由于這些患者癥狀不夠典型（很多疾病都有此表現(xiàn)），在疾病進(jìn)入病理晚期之前，PAH的診斷往往比較困難。
目前的治療，包括皮下或靜脈注射前列環(huán)素，本質(zhì)上都是擴(kuò)張血管的；雖然它們大大降低了死亡率，改善了生活質(zhì)量，但PAH的5年存活率低于60%。
Disease: pulmonary arterial hypertension (PAH)
-
Object: pulmonary arterial endothelial cells (PAECs)
下面是肺動(dòng)脈高壓進(jìn)展的模式圖，由于近端動(dòng)脈的閉塞和遠(yuǎn)端微血管的丟失，肺循環(huán)中的壓力逐漸升高，最終導(dǎo)致右側(cè)心力衰竭。
怎么進(jìn)行研究
大多數(shù)特發(fā)性PAH患者沒(méi)有已知的原因突變，因此，作者試圖通過(guò)研究PAH患者與健康對(duì)照組疾病相關(guān)組織中染色質(zhì)標(biāo)記和基因表達(dá)的分子差異來(lái)評(píng)估潛在的非編碼基因調(diào)控元件的變異對(duì)疾病機(jī)制的影響。
對(duì)來(lái)自遺傳性肺動(dòng)脈高壓(HPAH；攜帶BMPR2突變；n=2)和特發(fā)性肺動(dòng)脈高壓(IPAH；未知突變；n=8)和對(duì)照組(n=9；圖1A，補(bǔ)充圖1A)共19例來(lái)源的小肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(PAECs)進(jìn)行三個(gè)活性組蛋白標(biāo)記(H3K27ac，H3K4me1，H3K4me3)和RNA-Seq進(jìn)行了芯片測(cè)序序列分析。
從患者肺移植過(guò)程中采集的PAECs細(xì)胞培養(yǎng)3-5代，以獲得CHIP-SEQ實(shí)驗(yàn)所需的數(shù)量，并盡量降低批次效應(yīng)。
補(bǔ)充一下背景，參考http://www.itdecent.cn/p/f7d7bf8aec0b
使用到的樣本信息及分析軟件：
使用配對(duì)末端標(biāo)簽測(cè)序的染色質(zhì)相互作用分析技術(shù)CHIA-PET (Chromatin interaction analysis using paired-end tag sequencing. )
配對(duì)末端標(biāo)簽測(cè)序分析染色質(zhì)相互作用(chromatin interaction analysis by paired-end tag sequencing,ChIA-PET)技術(shù)是一項(xiàng)在全基因組范圍內(nèi)分析遠(yuǎn)程染色質(zhì)相互作用的新技術(shù)。它把染色質(zhì)免疫沉淀(chromatin immunoprecipitation,ChIP)技術(shù)、染色質(zhì)鄰近式連接(chromatin proximity ligation)技術(shù)、配對(duì)末端標(biāo)簽(paired-endtag,PET)技術(shù)和新一代測(cè)序(next-generation sequencing)技術(shù)融為一體,在基因組三維折疊和loop狀態(tài)下分析基因表達(dá)和調(diào)控。
染色質(zhì)遠(yuǎn)程交互在轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。2002年起,染色質(zhì)構(gòu)象捕獲技術(shù)(3C)及其衍生方法不斷發(fā)展,該方法用于揭示DNA與DNA之間的空間位置關(guān)系?；谂鋵?duì)末端標(biāo)簽測(cè)序的染色質(zhì)交互分析技術(shù)(ChIA-PET)將3C與ChIP相結(jié)合,可用于描繪全基因范圍內(nèi)特定蛋白介導(dǎo)的染色質(zhì)交互圖譜。ChIA-PET Tool為一個(gè)ChIA-PET數(shù)據(jù)處理的軟件,最初于2010年公開(kāi)發(fā)表。
下面這張圖是搜索自網(wǎng)絡(luò)介紹CHIA-PET背景相關(guān)示意圖，及相關(guān)數(shù)據(jù)分析軟件的。
下面正式開(kāi)始正文的描述：
研究流程如下：
從患者和病人肺動(dòng)脈分離PAECs進(jìn)行培養(yǎng)3-5代后進(jìn)行CTCF的CHIA-PET實(shí)驗(yàn)與活性增強(qiáng)子調(diào)控的靶基因進(jìn)行疾病相關(guān)基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析。
研究結(jié)果如下：
在PAH患者中發(fā)現(xiàn)活性增強(qiáng)子(H3K27ac)的廣泛重構(gòu)。而通用增強(qiáng)子標(biāo)記(H3K4me1)、啟動(dòng)子標(biāo)記(H3K4me3)和基因表達(dá)(RNAseq)沒(méi)有明顯變化。這表明發(fā)生改變的是活性增強(qiáng)子。
1.Extensive remodeling of H3K27ac in PAH patients vs controls
染色質(zhì)標(biāo)記pattern符合預(yù)期：H3K4me3和H3K27ac的peaks在轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)(TSS)富集，并與基因表達(dá)水平正相關(guān)(Pearson‘s R=0.51和R=0.59)，而H3K4me1的peaks更遠(yuǎn)離TSS且與RNA相關(guān)性較低(R=0.22)。作者觀察到HPAH患者與IPAH之間相似的Fold change變化(補(bǔ)充圖1F)，這表明分子檢測(cè)之間的信號(hào)是大致一致的(圖1b，c)。因此作者將IPAH和HPAH患者結(jié)合起來(lái)進(jìn)行所有后續(xù)分析。
對(duì)每種組蛋白標(biāo)記和RNAseq的差異區(qū)域(前1000個(gè)變異最大的peaks/基因)進(jìn)行的主成分分析(PCA)表明，只有H3K27ac能夠?qū)颖痉譃镻AH患者和健康對(duì)照組(圖1d；補(bǔ)充圖1C)。
作者還發(fā)現(xiàn)，在IPAH和對(duì)照(圖1e和補(bǔ)充圖1E)之間，有數(shù)千個(gè)位點(diǎn)在H3K27ac有顯著的差異變化(FDR<0.05)的11,701個(gè))，而在H3K4me1和H3K4me3的差異變化的peaks很少（在FDR<5%處沒(méi)有發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因，在<10%處只有少數(shù)區(qū)域顯著（圖未展示））。
由于前人的研究已經(jīng)在不同的樣本數(shù)據(jù)集中[9-11]已經(jīng)確定了一些在PAH中的差異表達(dá)基因，因此作者在部分樣品(兩個(gè)IPAH，兩個(gè)HPAH，四個(gè)對(duì)照)中對(duì)一些基因(圖1f)的基線表達(dá)水平進(jìn)行了qPCR驗(yàn)證，這些基因被選擇的原因是其啟動(dòng)子中具有一系列差異H3K27ac信號(hào)(圖1g)。
在qPCR檢測(cè)中，它們?cè)诨€基因表達(dá)水平上都沒(méi)有顯示出任何差異。但當(dāng)作者比較組蛋白標(biāo)記和RNAseq的樣品之間的成對(duì)相關(guān)性分析時(shí)發(fā)現(xiàn)RNAseq的變異水平要高得多，無(wú)論這些樣本來(lái)自PAH還是對(duì)照，這表明缺乏差異表達(dá)的基因可能部分是由樣本的異質(zhì)性導(dǎo)致的(補(bǔ)充圖1G)。
為了獲得對(duì)差異修飾的H3K27ac peaks的功能檢測(cè)，我們使用表觀基因組項(xiàng)目(Epigenomic roadmap project)[12]的數(shù)據(jù)評(píng)估了它們的染色質(zhì)狀態(tài)。
我們對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)使用了chromHMM狀態(tài)分析，HUVEC是與肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞最相似的細(xì)胞系。正如對(duì)活性標(biāo)記的預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)在測(cè)序結(jié)果中H3K27ac的peaks主要落在活性調(diào)控區(qū)域(包括啟動(dòng)子和增強(qiáng)子)，而很少在異染色質(zhì)中(圖1h，補(bǔ)充圖1H)。
此外，PAH患者PAECs中差異H3K27ac的peaks僅在活性增強(qiáng)子中富集(adjusted p-value (adj. p-val) < 1E ? 16; Odds Ratio (OR) = 4.4)，甚至在活性啟動(dòng)子中輕度缺失(adj. p-val = 0.03; OR = 0.93; 圖1g)。
綜上所述，這些結(jié)果表明，盡管PAH患者和健康對(duì)照組的PAEC在基因表達(dá)方面相似，但它們擁有活性染色質(zhì)區(qū)域的大規(guī)模重塑，特別是在活性增強(qiáng)子上。這可能表明，當(dāng)PAH患者PAECs仍處于內(nèi)皮狀態(tài)時(shí)，PAECs可能已經(jīng)準(zhǔn)備好對(duì)外界刺激做出不同于健康細(xì)胞的反應(yīng)。
2.Differentially H3K27-acetylated regions are disease relevant.
為了描述差異修飾區(qū)域和與PAH相關(guān)的分子機(jī)制，作者對(duì)可能受差異H3K27乙?；瘏^(qū)域調(diào)控的基因進(jìn)行了功能富集分析。
然而，與啟動(dòng)子中差異修飾區(qū)域的輕度缺失一致，作者發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)子標(biāo)記的差異peaks調(diào)控的基因沒(méi)有被富集到特定GO通路，只有少數(shù)非常廣泛的H3K27-ac標(biāo)記啟動(dòng)子peaks調(diào)控的基因富集到了幾條內(nèi)皮增殖分化相關(guān)的通路(補(bǔ)充圖2A)。
因此，由于差異的H3K27ac peaks富集在增強(qiáng)子，我們必須設(shè)計(jì)一種策略，將H3K27ac調(diào)節(jié)元件與其靶標(biāo)基因聯(lián)系起來(lái)。
隨后作者用CTCF作為錨定因子，通過(guò)成對(duì)末端標(biāo)簽測(cè)序(CHIA-PET)對(duì)來(lái)自健康供者的肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中的染色質(zhì)相互作用進(jìn)行了分析。得到的數(shù)據(jù)質(zhì)量高于ENCODE標(biāo)準(zhǔn)，與ENCODE CHIA-PET(補(bǔ)充圖2B)的范圍相似。共產(chǎn)生了21,805個(gè)loops，平均大小為283.7 kb(圖2a)，每個(gè)loop平均包含2個(gè)基因和25個(gè)H3K27ac峰(補(bǔ)充圖2C)。
作者觀察到CHIA-PET分析得到的loop中的H3K27ac peaks表現(xiàn)為一種高度協(xié)調(diào)的方式：在患者和對(duì)照組之間要么全部上調(diào)，要么全部下調(diào)(圖2b)。這種與PAH相關(guān)的染色質(zhì)變化在整個(gè)CTCF loop上的協(xié)同作用表明，它們可能作為獨(dú)立的調(diào)控元件在PAH發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。因此，也說(shuō)明不需要增強(qiáng)子-啟動(dòng)子的直接接觸，而是尋找可以使其高度協(xié)調(diào)的loops，或稱之為染色質(zhì)調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域(CRD)，可作為搜索增強(qiáng)子-靶基因相互作用的基礎(chǔ)。那么怎么去識(shí)別這種loops（CRD）呢？使用CHIA-PET loops兩個(gè)邊界上的H3K27ac信號(hào)的相關(guān)性作為該loops的協(xié)調(diào)強(qiáng)度的替代指標(biāo)，假設(shè)如果一個(gè)loop的最遠(yuǎn)位置的H3K27ac peak是相關(guān)的，那么中間的所有peak也將是相關(guān)的。
Define of CRD
當(dāng)邊界H3K27ac峰與p值<0.05呈正相關(guān)時(shí)，loops被定義為CRD(圖2C)。最近在淋巴母細(xì)胞系[13]中也提出了類似的CRDs概念。
作為統(tǒng)計(jì)驗(yàn)證，結(jié)果顯示負(fù)相關(guān)的p值分布沒(méi)有信號(hào)，而正相關(guān)在低p值時(shí)被富集(圖2d)。
然后，為了將基因與其特定的調(diào)控元件(增強(qiáng)子、啟動(dòng)子)聯(lián)系起來(lái)，作者利用每個(gè)CRD中每個(gè)基因-peaks對(duì)的H3K27ac信號(hào)與RNA表達(dá)之間的Pearson相關(guān)性，并將正相關(guān)(p值為0.05)定義為調(diào)控、增強(qiáng)子-基因和啟動(dòng)子-基因的相互作用，假定增強(qiáng)子和基因表達(dá)應(yīng)該是正相關(guān)的。
作者發(fā)現(xiàn)了更多的正相關(guān)信號(hào)，而負(fù)相關(guān)和隨機(jī)遺傳peaks鏈接的p值分布顯示沒(méi)有信號(hào)(圖2e)。
每個(gè)基因的增強(qiáng)子數(shù)量，被定義為與基因表達(dá)相關(guān)的H3K27ac峰，在CRD中比非CRD 中l(wèi)oops比例高，從而驗(yàn)證了我們的假設(shè)(圖2f，補(bǔ)充圖2C，d)。
CRD內(nèi)的基因示例如圖2g和補(bǔ)充圖2E所示。
為了評(píng)估CRD的生物學(xué)意義，我們對(duì)CRD中與不同活性元件相關(guān)的基因進(jìn)行了GO富集分析，并將其與非CRD 中l(wèi)oop相關(guān)的基因的GO分析進(jìn)行了比較。
對(duì)于與CRD相關(guān)的基因，我們發(fā)現(xiàn)與PAH相關(guān)的內(nèi)皮生物學(xué)和過(guò)程有很強(qiáng)的富集性，如“內(nèi)皮細(xì)胞增殖”(adj. p-value = 0.03, OR = 4.5)和“內(nèi)皮細(xì)胞遷移”(adj. p-value = 0.03, OR = 3.8；圖2H)，而對(duì)于非CRD連鎖基因，沒(méi)有GO terms顯著富集。
這突出了CRD對(duì)于研究增強(qiáng)子-基因調(diào)控相互作用的生物學(xué)相關(guān)性。
總體而言，這些結(jié)果表明，通過(guò)CRD將基因與PAH中不同活性的增強(qiáng)子聯(lián)系起來(lái)，捕獲了預(yù)期的疾病相關(guān)和細(xì)胞類型特異性信號(hào)，并說(shuō)明了將增強(qiáng)子與其目標(biāo)基因聯(lián)系起來(lái)對(duì)理解疾病機(jī)制的重要性。
同時(shí)，發(fā)現(xiàn)這些內(nèi)皮細(xì)胞和PAH特異的功能，證明了我們的數(shù)據(jù)和分析方法的適用性，可以更多地了解PAH涉及的病理生物學(xué)。
4.Known PAH TFs are differentially active in PAH vs controls.
考慮到CRD內(nèi)內(nèi)皮功能和疾病特異性GO通路的不同活性區(qū)域的強(qiáng)烈富集，作者想更深入挖掘這些富集的分子通路的相關(guān)機(jī)制。
根據(jù)之前一項(xiàng)研究的結(jié)果，作者發(fā)現(xiàn)調(diào)控組蛋白修飾水平的遺傳變異通常位于TF結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)[14]，因此作者提出一個(gè)假設(shè)：H3K27ac信號(hào)的差異是由一組特定的與疾病相關(guān)的TF驅(qū)動(dòng)的。并且他們最近開(kāi)發(fā)一個(gè)軟件diffTF的工具，并正式提出了這一想法，該工具基于兩組樣本之間的全基因組H3K27ac信號(hào)來(lái)估計(jì)差異TF活性[8]。
簡(jiǎn)而言之，diffTF將H3K27ac信號(hào)的差異聚集在給定TF的所有假定結(jié)合位點(diǎn)附近，作為其差異活性的估計(jì)(見(jiàn)方法，補(bǔ)充圖3A，B)。在這里，我們應(yīng)用diffTF來(lái)量化PAH患者和對(duì)照組之間在我們數(shù)據(jù)中PAECs表達(dá)的所有TF的差異活動(dòng)。
總共，我們發(fā)現(xiàn)了318個(gè)差異活性因子(代表了640個(gè)測(cè)試基序中的339個(gè)；FDR 0.001；圖3a，補(bǔ)充數(shù)據(jù)3)。
有趣的是，當(dāng)作者將TF分為激活因子和抑制因子時(shí)(在分類模式[8]中使用diffTF)，他們發(fā)現(xiàn)患者和對(duì)照之間的差異TF活性和差異表達(dá)之間總體上存在顯著的相關(guān)性(補(bǔ)充圖3B)。
這表明TF表達(dá)的微小變化可以導(dǎo)致可檢測(cè)到的活性差異，這可能是由于H3K27ac信號(hào)在所有結(jié)合位點(diǎn)上的聚集所導(dǎo)致的[8]。
總而言之，在之前與PAH相關(guān)的20個(gè)TF中(編譯自https://monarchinitiative.org, https:// www.opentargets.org/, and ref. 15見(jiàn)方法；補(bǔ)充數(shù)據(jù)4)，16個(gè)被鑒定為差異活性TF，并且它們?cè)诓町惢钚訲F中被強(qiáng)烈富集，而不管用于定義差異活性TF的閾值如何(圖3b)。
這表明我們?cè)u(píng)估TF活性的方法對(duì)于識(shí)別潛在的重要疾病驅(qū)動(dòng)因素TF是可靠且靈敏的。SOX17，最近才被確認(rèn)為PAH相關(guān)TF[7,16]在我們的PAH患者中也有顯著的缺失調(diào)節(jié)(補(bǔ)充數(shù)據(jù)4)。
一些TF(17個(gè)代表18個(gè)基序；圖3a)顯示出比已知的PAH-TF更強(qiáng)的PAH和對(duì)照之間的差異活性，這表明它們可能是導(dǎo)致該疾病的新候選調(diào)控因子。這些新發(fā)現(xiàn)的TF包括AP1復(fù)合體(BATF、FOSL1、JUN、JUND、FOSL2以及ATF1和ATF7，它們都有相似的結(jié)合位點(diǎn)，因此應(yīng)該被認(rèn)為是無(wú)法區(qū)分的)，RFX家族的成員(RFX3、RFX4，又是相似的基序)，CREB5和E4F1在患者中活性更高，以及ARID3A，F(xiàn)OX家族的成員(FOXL1，F(xiàn)OXG1，F(xiàn)OXJ3，也是類似的。
AP1復(fù)合體是一種已知的促炎因子[17]，鑒于作者以往的發(fā)現(xiàn)，炎癥在PAH[18,19]中扮演著重要的角色，因此特別令人感興趣。類似地，E4F1和ARID3A已被證明與p53[20,21]的特定功能相互作用與激活，最近作者研究發(fā)現(xiàn)，在與炎癥相關(guān)的過(guò)程中，當(dāng)缺失BMPR2時(shí)，p53特異性上調(diào)。CREB5已被認(rèn)為是肺組織中的一個(gè)缺氧反應(yīng)基因[23]，其活性增強(qiáng)可能是疾病marker。RFX家族的轉(zhuǎn)鐵蛋白長(zhǎng)期以來(lái)被認(rèn)為與膠原的抑制有關(guān)[24]，而膠原又是一個(gè)已知的PAH相關(guān)基因(補(bǔ)充數(shù)據(jù)4)。最后，TBX4與TBX3具有高度相似的結(jié)合位點(diǎn)，其突變與兒童期發(fā)病的PAH有關(guān)[25]。這些例子表明，許多新預(yù)測(cè)的PAH-TF可能確實(shí)在發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮了作用，并為進(jìn)一步研究提供了重要的研究基礎(chǔ)。
4.Gene regulatory network and PAH-specific TFs highlight PAH biology.
下一步作者想要研究在PAH中受不同活性TF調(diào)控的靶基因。
為此，作者試圖建立一個(gè)PAH特異的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，將TF與它們的靶基因聯(lián)系起來(lái)。
前面，作者已經(jīng)定義了基因和它們的增強(qiáng)子之間的聯(lián)系(圖2c)，所以現(xiàn)在只需要把TF與它們調(diào)節(jié)的調(diào)控元件聯(lián)系起來(lái)。
為此，作者設(shè)計(jì)了一種基于相關(guān)性的方法，如果(I)調(diào)控元件具有假定的TF結(jié)合位點(diǎn)，并且(II)與TF的表達(dá)水平顯著相關(guān)(正或負(fù)，反映激活因子和抑制因子)，則將TF與其靶調(diào)控元件聯(lián)系起來(lái)(圖4a)。
這假設(shè)TF表達(dá)的任何變化都應(yīng)該導(dǎo)致它正在調(diào)控的增強(qiáng)子和啟動(dòng)子的活性的變化。
注意，該方法基于不同個(gè)體的TF表達(dá)和增強(qiáng)子信號(hào)的協(xié)變，并且與條件之間的差異表達(dá)/信號(hào)無(wú)關(guān)。
為了估計(jì)TF-peak的FDR，我們使用TF與不包含其motifs的峰的相關(guān)性作為背景來(lái)計(jì)算經(jīng)驗(yàn)FDR。我們選擇20%的FDR作為界限，因?yàn)檫@似乎可以最大化“一致”交互的比例，從而一致被定義為TF的活動(dòng)和它的目標(biāo)peak沿著相同的方向進(jìn)行的交互(圖4b)。值得注意的是，我們觀察到<20%的增強(qiáng)子與鄰近的基因相關(guān)(就到TSS的距離而言)，這再次強(qiáng)調(diào)了細(xì)胞類型特異的基因-增強(qiáng)子互作的重要性(圖4c)。
為了專注于解決疾病特異性的相互作用，作者選擇了由上面獲得的假定的PAH-TFs調(diào)控的子網(wǎng)絡(luò)。一個(gè)PAH特異的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，包括116個(gè)TFs，1880個(gè)目標(biāo)基因和5342個(gè)相互作用網(wǎng)絡(luò)(圖4d-f，補(bǔ)充數(shù)據(jù)5)。為了給網(wǎng)絡(luò)分配方向性，作者使用了基于Motif的diffTF計(jì)算的TF活性，還使用了CHIP-seq數(shù)據(jù)(參見(jiàn)方法)。TFs在基序和芯片序列數(shù)據(jù)之間的方向性不一致，但在至少一項(xiàng)分析中具有顯著性，被標(biāo)記為“混合證據(jù)”。然后，這個(gè)網(wǎng)絡(luò)被用來(lái)查詢特定基因集合之間的調(diào)控關(guān)系。
作為第一個(gè)例子，我們可視化驗(yàn)證了涉及先前已知的PAH相關(guān)TF的調(diào)控相互作用(圖4g，補(bǔ)充數(shù)據(jù)4)。
在306個(gè)已知的PAH相關(guān)基因中，有209個(gè)在我們的數(shù)據(jù)中表達(dá)，其中我們的GRN覆蓋了9個(gè)TF和45個(gè)靶基因。
最后作者發(fā)現(xiàn)這些基因群分為一個(gè)由GATA6和SP1、SP2和SP4主導(dǎo)的主要調(diào)控簇，以及受STAT4、ERG和THRB等調(diào)控的幾個(gè)較小的調(diào)控簇。
這表明，雖然有不同的調(diào)控途徑受到影響，但許多已知的PAH基因參與了同一級(jí)聯(lián)調(diào)控。
為了評(píng)估基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的生物學(xué)意義，作者對(duì)目的基因進(jìn)行了GO富集分析，以所有表達(dá)的基因?yàn)楸尘?，排除了TF。
我們發(fā)現(xiàn)超過(guò)250個(gè)GO terms在目標(biāo)基因中顯著富集(補(bǔ)充數(shù)據(jù)6；圖5a中顯示的子集)。
許多富集的生物學(xué)過(guò)程與內(nèi)皮生物學(xué)有關(guān)，也與PAH有關(guān)。包括細(xì)胞遷移和管狀形態(tài)發(fā)生(“regulation of cell migration” (OR = 1.4, adj. p-val = 4.1e-3) and “regulation of tube size” (OR = 2.5, adj. p-val = 0.011；補(bǔ)充數(shù)據(jù)6))，它們?cè)赑AH來(lái)源的內(nèi)皮細(xì)胞中是下調(diào)的。
其他通路，如“細(xì)胞對(duì)皮質(zhì)類固醇刺激的反應(yīng)”(OR = 3.2, adj. p-val = 0.02)和“血管收縮調(diào)節(jié)”(OR = 3.7, adj. p-val = 0.016)可能是疾病和患者在肺移植前接受的治療的結(jié)果，因?yàn)樗谢颊叨冀邮芰四撤N血管擴(kuò)張劑藥物的治療(圖5a，補(bǔ)充數(shù)據(jù)1)。
隨后作者確定的最具體的GO是“SMAD蛋白復(fù)合物assembly”，這一過(guò)程受到導(dǎo)致HPAH的BMPR2突變的影響(圖5B)。
總體而言，這些terms表明，我們的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，由PAH患者不同活性的TF驅(qū)動(dòng)，能夠恢復(fù)預(yù)期的生物學(xué)過(guò)程，從而驗(yàn)證了該方法。
接下來(lái)，作者使用PAH調(diào)控網(wǎng)絡(luò)來(lái)揭示疾病發(fā)生機(jī)制的過(guò)程。在PAH特異性調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，最富集的GO term是“平滑肌細(xì)胞分化的正調(diào)控(positive regulation of smooth muscle cell differentiation)”，為此，作者確定了10個(gè)基因中的7個(gè)(OR = 17, adj. p-val = 1.9e-3；圖5a,c)。
他們還發(fā)現(xiàn)了其他與肌肉生物學(xué)相關(guān)的生物過(guò)程，如“上皮向間充質(zhì)轉(zhuǎn)化”和“中胚層發(fā)育”，這些都是富集程度較高的通路(圖5c)。向GRN查詢這些GO中TF活性的方向性，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)調(diào)節(jié)它們的TF在PAH中更活躍，從而表明這些通路在PAH中上調(diào)。隨著“細(xì)胞增殖”的增加(OR = 1.4, adj. p-val = 4.9e-3)這可能提示增殖的內(nèi)皮細(xì)胞開(kāi)始分化為平滑肌樣細(xì)胞的機(jī)制。這是如何發(fā)生的一個(gè)線索來(lái)自term“對(duì)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β的反應(yīng)”(OR = 1.8, adj. p-val = 0.045)。提示內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)生長(zhǎng)因子刺激的異常反應(yīng)可能導(dǎo)致細(xì)胞增殖和EndMT，并可能最終促進(jìn)PAH中典型的平滑肌細(xì)胞過(guò)度增殖[26]。調(diào)控網(wǎng)絡(luò)表明，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子家族TGFβ1，也包括在平滑肌分化GO term中，受SP家族(SP1, SP2, SP4)的TF控制，這些TF在肺動(dòng)脈高壓患者中具有不同的活性(圖5d)。更重要的是，作者發(fā)現(xiàn)通過(guò)TGFβ激活的SMAD2 TF在肺動(dòng)脈高壓中具有很強(qiáng)的活性(圖5e)，因此提示肺動(dòng)脈高壓患者內(nèi)皮細(xì)胞中TGFβ通路的調(diào)控缺失與疾病發(fā)生相關(guān)。它還提示與炎癥(SP家族)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(SMADS)和EndMT(SNAI1)相關(guān)的TF之間存在以前未知的聯(lián)系。
總之，我們的數(shù)據(jù)表明，肺動(dòng)脈高壓患者活躍的染色質(zhì)景觀在調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞分化相關(guān)基因的增強(qiáng)子上發(fā)生了特異性的改變，并可能對(duì)TGFβ信號(hào)做出異常反應(yīng)。這也解釋了RNA和H3K27ac標(biāo)記之間缺乏相關(guān)性的原因。因此，我們預(yù)測(cè)，在內(nèi)皮生長(zhǎng)或信號(hào)因子的刺激下，這些靶基因中的一些在PAH患者和對(duì)照組中的表達(dá)反應(yīng)將顯著不同。
5.RNA response to growth factor reflects steady state H3K27ac.
為了驗(yàn)證PAH患者PAECs中的增強(qiáng)子在啟動(dòng)特定基因以對(duì)生長(zhǎng)因子刺激做出異常反應(yīng)的假設(shè)，作者在一組預(yù)測(cè)在PAH患者中被不同啟動(dòng)的基因中，測(cè)量了PAECs中相關(guān)的三個(gè)刺激的反應(yīng)。這些基因被選擇來(lái)代表發(fā)現(xiàn)富集在PAH GRN中的不同過(guò)程，并且需要(在作者的GRN中)連接到一個(gè)不同的H3K27-acetylated peak。
具體地說(shuō)，我們選擇了NOS3和HTR1B(血管系統(tǒng))，TSC22D1(基本轉(zhuǎn)錄過(guò)程)，YAP1和DKK1(中胚層發(fā)育)，NFE2L2(刺激反應(yīng))和TGFβ受體2(TGFβ的直接靶標(biāo))。
我們使用了8個(gè)肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞株-4個(gè)來(lái)自患者(2個(gè)IPAH和2個(gè)HPAH)和4個(gè)來(lái)自對(duì)照組-并使它們受到三種與內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)的不同生長(zhǎng)因子/信號(hào)分子的刺激：血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF10 ng/ml)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGFβ；10 ng/ml)和5-羥色胺(serotonin，10uM)，每種刺激24小時(shí)，然后我們對(duì)選定的基因進(jìn)行qPCR，比較PAH和對(duì)照組的表達(dá)。
正如從全局RNA-Seq數(shù)據(jù)中結(jié)果的那樣，在未刺激的肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中，患者和對(duì)照組之間沒(méi)有檢測(cè)到顯著變化(圖6a)。
然而，我們發(fā)現(xiàn)大多數(shù)基因在至少一種刺激下在患者和對(duì)照組之間表現(xiàn)出顯著的差異(補(bǔ)充圖4A)。
重要的是，當(dāng)比較PAH和對(duì)照組時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)基線時(shí)增強(qiáng)子活性(H3K27ac)的變化與內(nèi)皮信號(hào)下其靶基因表達(dá)的變化之間存在很強(qiáng)的相關(guān)性(圖6a)。
這證實(shí)了這樣的觀點(diǎn)，即這些基因正被增強(qiáng)子激活，在PAH患者中以異常的方式做出反應(yīng)，從而可能導(dǎo)致異常生長(zhǎng)或分化。對(duì)于TGF-β刺激，我們發(fā)現(xiàn)差異調(diào)控基因的增強(qiáng)子在刺激時(shí)變得異常活躍(圖6b)。
為了擴(kuò)大這些觀察到的功能重要性，作者的結(jié)果還表明，在每種刺激中，一些基因的蛋白質(zhì)水平(用WB測(cè)量)與mRNA水平一致(圖6c)。對(duì)于受磷酸化高度調(diào)控的YAP1，作者還通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了磷酸化形式根據(jù)其RNA水平的變化(補(bǔ)充圖4B)。
下面的例子可以作為在PAH疾病機(jī)制背景下解釋數(shù)據(jù)的概念的證明：
首先，VEGF通常誘導(dǎo)NOS3[27]。在PAH-PAECs中，其增強(qiáng)子與對(duì)照-PAECs相比H3K27ac信號(hào)減少了。
同時(shí)NOS3 mRNA和蛋白對(duì)VEGF的反應(yīng)僅在對(duì)照組肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中增強(qiáng)。
其次，5-羥色胺通常通過(guò)HTR1B受體C(HTR1BRC)刺激血管生成。
然而，在PAH-PAEC中，HTR1BRC的增強(qiáng)子顯示H3K27ac信號(hào)減弱，似乎可以使細(xì)胞對(duì)抗5-羥色胺刺激后HTR1BRC mRNA和蛋白的誘導(dǎo)，從而提供了另一種破壞PAH血管生成的方式，這與5-羥色胺反應(yīng)中NOS3的減少是一致的?；蛘?，NOS3增強(qiáng)劑子H3K27ac標(biāo)記的減少可能會(huì)改變其在PAH中的反應(yīng)。
第三，YAP1促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成[28]，但是YAP1在內(nèi)皮細(xì)胞中不受TGFβ的調(diào)節(jié)[29]。在此，TGFβ對(duì)肺動(dòng)脈高壓肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞YAP1和NOS3表達(dá)的上調(diào)也可能是這些細(xì)胞血管生成受損的原因。
最后，新的TF，如NFE2L2和TSC22D1，似乎被TGFβ異常上調(diào)，可能與干擾這一途徑的新機(jī)制有關(guān)。因此，H3K27ac標(biāo)記幫助我們發(fā)現(xiàn)在內(nèi)皮再生中重要的新通路和效應(yīng)器，以響應(yīng)在疾病(如肺動(dòng)脈高壓)中受損的刺激。
總而言之，這些實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了作者的預(yù)測(cè)，即PAH患者的內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)生長(zhǎng)因子刺激的反應(yīng)方式與健康對(duì)照組明顯不同，這一機(jī)制可能涉及增強(qiáng)子啟動(dòng)。
綜上所述，本研究結(jié)果為肺動(dòng)脈高壓的表觀遺傳學(xué)基礎(chǔ)提供了AP1、TGFβ、5-羥色胺和VEGF信號(hào)的異常，這些信號(hào)共同導(dǎo)致炎癥、異常的血管生成和EndMT，以及平滑肌細(xì)胞增殖的傾向，這些都是肺動(dòng)脈高壓的特征。此外，結(jié)果表明，潛在的治療方法不僅應(yīng)該考慮它們對(duì)細(xì)胞表面受體或信號(hào)通路的影響，而且應(yīng)該考慮它們是否逆轉(zhuǎn)了異常的表觀遺傳的影響。
小結(jié)
環(huán)境和表觀遺傳因素往往在多基因疾病中起重要作用。
作者從患者和對(duì)照組(n=19)的肺組織中獲得肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(PAECs)，并進(jìn)行染色質(zhì)、轉(zhuǎn)錄和相互作用分析。
作者觀察到PAH-PAEC中活性增強(qiáng)子的廣泛重構(gòu)，并鑒定了數(shù)百個(gè)不同活性的TF，但在穩(wěn)定狀態(tài)下發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄變化很小。
設(shè)計(jì)了一個(gè)疾病特異性的增強(qiáng)子-基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并預(yù)測(cè)PAH患者PAECs中的啟動(dòng)增強(qiáng)子被不同活性的TF激活，導(dǎo)致其對(duì)內(nèi)皮信號(hào)的異常反應(yīng)，這可能導(dǎo)致血管生成障礙和內(nèi)皮到間質(zhì)的轉(zhuǎn)變。
在體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了在轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子或5-羥色胺刺激的肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中選擇靶基因的預(yù)測(cè)。
本研究強(qiáng)調(diào)了染色質(zhì)狀態(tài)和活性增強(qiáng)子在疾病相關(guān)的PAH細(xì)胞類型中的作用。
討論
本研究表明，PAH患者的小肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(PAECs)在穩(wěn)態(tài)時(shí)表現(xiàn)出增強(qiáng)子的重塑，但沒(méi)有顯示任何顯著差異表達(dá)的基因。這一明顯的矛盾使作者提出科學(xué)假設(shè)：增強(qiáng)子可能啟動(dòng)PAH中的PAECs，使其對(duì)內(nèi)皮信號(hào)做出異常反應(yīng)，作者在實(shí)驗(yàn)上通過(guò)一些基因證實(shí)了這一點(diǎn)。
使用染色質(zhì)構(gòu)象和基于相關(guān)性的方法將基因與其近端和遠(yuǎn)端的調(diào)控元件聯(lián)系起來(lái)，作者發(fā)現(xiàn)了特異的內(nèi)皮和PAH相關(guān)過(guò)程，表明PAH中的PAEC在正常的內(nèi)皮信號(hào)作用下向內(nèi)皮到間質(zhì)的轉(zhuǎn)變啟動(dòng)。這突出了將基因與其遠(yuǎn)端調(diào)控元件聯(lián)系起來(lái)以揭示生物功能的重要性。
通過(guò)使用diffTF[8]將H3K27ac信號(hào)轉(zhuǎn)換為活性TF分布，我們?cè)诨颊吆蛯?duì)照組之間識(shí)別出了大量不同活性的TF，包括幾乎所有先前已知的PAH相關(guān)TF。
結(jié)合RNA, ChIA-PET和H3K27ac數(shù)據(jù)，作者設(shè)計(jì)了一種方法來(lái)生成基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)能夠捕獲與疾病相關(guān)的生物學(xué)過(guò)程。除了生物學(xué)上的關(guān)聯(lián)，這也表明(a)從供體肺中獲取并培養(yǎng)了幾代的細(xì)胞保持其調(diào)控狀態(tài)，潛在地編碼為表觀遺傳記憶，以及(b)本研究中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)方法能夠捕捉到重要的生物學(xué)功能。
作者注意到，其構(gòu)建的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)是基于TF和調(diào)控元件之間的相互作用，這些元件在不同的個(gè)體之間是不同的。
因此，我們不太可能找回高度保守和嚴(yán)格調(diào)控的過(guò)程，而是那些可能因個(gè)體而異的過(guò)程，因此可能在聚集在導(dǎo)致疾病的分子途徑上發(fā)揮作用。同時(shí)還注意到，使用CTCF-CHIA-PET作為調(diào)用染色質(zhì)調(diào)節(jié)域的基礎(chǔ)的一個(gè)缺陷是，將對(duì)任何沒(méi)有被CTCF劃定的基因loop失去觀察力。
通過(guò)使用疾病特異性轉(zhuǎn)錄因子探索這個(gè)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，作者在top GO term中確定了與平滑肌細(xì)胞分化相關(guān)的過(guò)程。這一點(diǎn)特別有趣，因?yàn)樽髡咧暗陌l(fā)現(xiàn)表明，PAEC中BMPR2活性的降低促進(jìn)了EndMT[26]。然而，這一先前的發(fā)現(xiàn)是對(duì)BMPR2下調(diào)的特異性反應(yīng)，并由HMGA1和Slug介導(dǎo)。
在本次研究的網(wǎng)絡(luò)分析中，作者發(fā)現(xiàn)，overall regulatory state可能會(huì)推動(dòng)細(xì)胞走向EndMT。這一點(diǎn)特別有趣，因?yàn)檫@次并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)BMPR2的顯著下調(diào)。Slug和HMGA1是我們網(wǎng)絡(luò)中的靶基因，可能有助于EndMT作為PAH過(guò)程的富集。
最后，盡管沒(méi)有發(fā)現(xiàn)任何差異表達(dá)的基因，PAECs中的H3K27ac水平對(duì)選擇的一組基因的內(nèi)皮信號(hào)因子的表達(dá)變化具有很高的預(yù)測(cè)性。
這表明，雖然這些從肺動(dòng)脈最內(nèi)皮層分離的細(xì)胞仍然具有內(nèi)皮命運(yùn)，但它們確實(shí)顯示出向間充質(zhì)轉(zhuǎn)化為平滑肌細(xì)胞的啟動(dòng)。
這種轉(zhuǎn)變可能是由炎癥以及5-羥色胺和TGFβ等信號(hào)分子觸發(fā)的。EndMT導(dǎo)致抑制平滑肌細(xì)胞增殖的內(nèi)皮因子缺失，從而導(dǎo)致PAH患者增生的平滑肌細(xì)胞擴(kuò)張的新生內(nèi)膜堵塞血管腔。
總而言之，本研究提出了一個(gè)大的框架，用于在增強(qiáng)子介導(dǎo)的基因網(wǎng)絡(luò)中集成多個(gè)組學(xué)數(shù)據(jù)，允許識(shí)別驅(qū)動(dòng)疾病特定途徑的基因，并對(duì)疾病機(jī)制提供見(jiàn)解。
它表明，穩(wěn)態(tài)表達(dá)分析僅限于機(jī)制涉及對(duì)刺激的異常反應(yīng)的系統(tǒng)?？紤]到增強(qiáng)子，特別是活性標(biāo)記H3K27ac的增強(qiáng)子，可能會(huì)導(dǎo)致僅靠基因表達(dá)或啟動(dòng)子分析無(wú)法獲得的見(jiàn)解。看看H3K27ac標(biāo)記的增強(qiáng)子是否可以在其他系統(tǒng)中充當(dāng)啟動(dòng)因子，從而在某種程度上為穩(wěn)態(tài)研究增加了一個(gè)更動(dòng)態(tài)的視角，這將是一個(gè)有趣的事情。
Data availability
The raw sequencing data are available at the Gene Expression Omnibus (GEO) data repository under the accession number GSE126325. Chromatin modififications profifiling data have been deposited under the accession number GSE126322. RNA-Seq data have been deposited under the accession number GSE126262. Chromatin interaction profifiling (ChIA-PET) data mediated by CTCF have been deposited under the accession number GSE139234. The source data underlying Figs. 1f, 2a, b, d, e, h, 6c and Supplementary Figs. 2a, 4a, b are provided as a Source Data fifile.
Code availability
Code is available upon request from the corresponding author judith.zaugg@embl.de.
Received: 4 March 2019; Accepted: 13 March 2020;
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