01一、文章信息

發(fā)表雜志名稱：International Journal of Biological Macromolecules

中文標(biāo)題：單細胞和空間分析揭示 VSIG4+S100A10 + 腫瘤相關(guān)巨噬細胞（TAMs）對膠質(zhì)母細胞瘤免疫抑制及抗 PD-1 免疫治療的影響

英文標(biāo)題：Single-cell and spatial analyses reveal the effect of VSIG4+S100A10+TAMs on the immunosuppression of glioblastoma and anti-PD-1 immunotherapy

影響因子：8.5

發(fā)表日期：2025 年 5 月

01二、研究概述

膠質(zhì)母細胞瘤（GBM）治療中，針對腫瘤免疫微環(huán)境（TIME）的治療策略具有潛力，但免疫檢查點抑制劑類輔助免疫治療僅對部分患者有效。GBM 相關(guān)巨噬細胞大量參與腫瘤進程，深入探究其對免疫治療療效的影響對改善治療效果至關(guān)重要。本研究整合 bulk RNA 測序、單細胞 RNA 測序（scRNA-seq）和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)等技術(shù)，結(jié)合流式細胞術(shù)、共培養(yǎng)細胞實驗等，對 16 例患者樣本進行分析，發(fā)現(xiàn) VSIG4 在巨噬細胞上高表達且與 TIME 相關(guān)，可促進巨噬細胞向 M2 型極化并推動 GBM 進展。同時首次鑒定出 VSIG4+S100A10+TAMs 亞群，該亞群與多種 T 細胞共定位，抑制 T 細胞免疫應(yīng)答，是 GBM 不良預(yù)后的獨立預(yù)測指標(biāo)，在抗 PD-1 免疫治療無應(yīng)答患者中大量聚集，為 GBM 免疫治療提供新靶點和方向。

01三、研究結(jié)果

（一）VSIG4 在 TAM 中的表達與免疫抑制性微環(huán)境呈顯著正相關(guān)

作者通過對 Gill 等人數(shù)據(jù)的差異基因分析，在 bulk RNA 數(shù)據(jù)集里篩選出在腫瘤樣本中顯著高表達且變異大的基因，其中 CHI3L1、SERPINA3、AQP1 和 VSIG4 在腫瘤樣本中過表達（圖 1A）。將 TCGA-GBM 和 CGGA-GBM 隊列樣本依據(jù)腫瘤微環(huán)境（TME）免疫評估分為免疫激活（IA）組和免疫抑制（IS）組后，發(fā)現(xiàn) VSIG4 在 IS 樣本中顯著高表達（TCGA-GBM：p=0.032；CGGA-GBM：p=0.0084），表明 VSIG4 表達與免疫抑制存在強正相關(guān)（圖 1B、C）。運用 EPIC、ESTIMATE、TIMER 和 CIBERSORT 等多種方法對這兩個隊列進行免疫浸潤分析，結(jié)果顯示 VSIG4 表達與巨噬細胞浸潤呈正相關(guān)，尤其與 M2 型巨噬細胞關(guān)聯(lián)密切（圖 1D、E）。作者按照特定方法誘導(dǎo) THP-1 細胞分化，觀察到細胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，THP-1 細胞為小圓形且高折光性，分化為 M0 巨噬細胞時伸出偽足、體積增大、胞質(zhì)疏松呈橢圓形，M1 型巨噬細胞貼壁且部分呈梭形、細胞器突起清晰，TAM 細胞多為混合形態(tài)、體積更大、突起延長且分泌物增多（圖 1F）。通過 qPCR 和流式細胞術(shù)驗證 M0 建模成功后，進一步探究 TAM 最佳建模條件，發(fā)現(xiàn)與兩種 GBM 細胞系（U87-MG 和 U118-MG）共培養(yǎng)的 TAM 中 VSIG4 表達顯著升高（圖 1G、H），且 TCGA 和 GTEx 數(shù)據(jù)的比較分析以及 CAPTC 隊列的蛋白質(zhì)組差異評估也支持這一發(fā)現(xiàn)，同時 HPA 數(shù)據(jù)庫的 IHC 結(jié)果顯示膠質(zhì)瘤級別越高，VSIG4 表達越高。綜上，作者通過多方面實驗和數(shù)據(jù)分析，證實了 VSIG4 在 TAM 中的表達與免疫抑制性微環(huán)境存在顯著正相關(guān)。

（二）VSIG4 表達隨 TAMs 分化逐漸上調(diào)

為全面分析 VSIG4 基因在 GBM 中的特征，作者采用 BBKNN 算法整合兩個數(shù)據(jù)集的 27 個樣本（圖 S2D），經(jīng)過去除雙細胞（圖 S2B）、評估 RNA 污染（圖 S2C）和嚴(yán)格質(zhì)量控制后，獲得 83085 個適用于后續(xù)分析的細胞，涵蓋原發(fā)、復(fù)發(fā)、對新輔助治療有應(yīng)答和無應(yīng)答等組別（圖 2A）。利用 infercnv 分析推斷染色體拷貝數(shù)變異，通過 7 號染色體擴增和 10 號染色體缺失識別出惡性細胞（圖 2B、S2E）。依據(jù) Neftel 等人的基因集，運用 ssGSEA 將腫瘤細胞分為 MES1 樣、MES2 樣、OPC 樣、AC 樣、NPC1 樣和 NPC2 樣六種亞型，并界定出 21 種不同細胞類型，包括癌癥相關(guān)成纖維細胞（CAFs）、周細胞、內(nèi)皮細胞、少突膠質(zhì)細胞、Mg_TAM、Mo_TAM 等（圖 2C）。結(jié)果顯示 VSIG4 主要在 Mg_TAM、Mo_TAM、單核細胞和樹突狀細胞中表達，在其他細胞類型中極少檢測到（圖 2D）。作者借助 Monocle3 軟件包對髓系細胞進行細胞軌跡推斷，在原發(fā)和復(fù)發(fā)腫瘤中探究髓系細胞分化軌跡以尋找成簇基因表達模式（圖 S2F），發(fā)現(xiàn) VSIG4 位于第四簇（圖 2F）；同時通過基因軌跡分析，發(fā)現(xiàn) VSIG4 出現(xiàn)在相關(guān)基因趨勢的第二條軌跡中，該軌跡還包含 S100A10、IL2RA、GPNMB 和 TMIGD3 等基因（圖 2E）。這種雙重軌跡分析還發(fā)現(xiàn)了多個與 VSIG4 表達模式相似的基因，如在 GBM 中具有免疫抑制作用的 CSF1R 和 TREM2（圖 2G）。由此可見，作者通過一系列單細胞分析技術(shù)，得出 VSIG4 表達隨 TAM 分化而增加且可能具有類似免疫抑制靶點功能的結(jié)論。

（三）VSIG4 促進 TAM 向 M2 表型極化

TAMs 分為促炎性 M1 型和免疫抑制性 M2 型，后者會促進腫瘤免疫抑制微環(huán)境形成。作者在 TCGA-GBM 和 CGGA-GBM 兩個大型隊列中進行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn) VSIG4 表達與三種 M2 型 TAM 標(biāo)志物（MRC1、ARG1、CLEC7A）存在顯著正相關(guān)，其中在 TCGA-GBM 隊列中，VSIG4 與 MRC1 相關(guān)系數(shù) R=0.62、與 ARG1 相關(guān)系數(shù) R=0.23、與 CLEC7A 相關(guān)系數(shù) R=0.74；在 CGGA-GBM 隊列中，VSIG4 與 MRC1 相關(guān)系數(shù) R=0.44、與 ARG1 相關(guān)系數(shù) R=0.48、與 CLEC7A 相關(guān)系數(shù) R=0.89（圖 3A、B）。按與 VSIG4 的相關(guān)性對基因進行排序后進行 GSEA 分析，結(jié)果顯示 M2 相關(guān)基因集顯著富集（TCGA-GBM NES=3.03；CGGA-GBM NES=1.95），表明在 bulk 轉(zhuǎn)錄組水平上 VSIG4 表達與 M2 極化存在關(guān)聯(lián)（圖 3C、D）。使用 scgate 算法對單細胞樣本按 VSIG4 表達進行分選（圖 S3A），發(fā)現(xiàn) VSIG4 高表達的細胞 M2 評分升高、M1 評分降低，且具有統(tǒng)計學(xué)意義，進一步證實 VSIG4 與 M2 極化呈正相關(guān)（圖 3E）。為進一步驗證，作者在與 GBM 細胞共培養(yǎng)的 TAM 中采用 siRNA 介導(dǎo)的 VSIG4 敲低（圖 S3B），通過流式細胞術(shù)對 CD11b、CD86 和 CD206 標(biāo)記的細胞進行分選（圖 3F），結(jié)果顯示靶向 VSIG4 的 siRNA 處理顯著降低了 M2/M1 比值，且對已確立的 M1 和 M2 標(biāo)志物進行 qRT-PCR 驗證也得到一致結(jié)果（圖 S3C、D）。綜上，作者通過隊列分析、基因富集分析和細胞實驗，證實了 VSIG4 可促進 GBM 相關(guān)巨噬細胞向 M2 表型極化。

（四）抑制 TAM 中的 VSIG4 可阻礙 GBM 的遷移、侵襲和抗凋亡能力

GBM 具有高度異質(zhì)性，主要分為 OPC 樣、NPC 樣、AC 樣和 MES 樣亞型。作者采用 ssGSEA 算法根據(jù) Neftel 等人的分類對 TCGA-GBM 和 CGGA-GBM 隊列樣本進行評分，并與 VSIG4 表達水平進行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)包括 MES1 樣和 MES2 樣 GBM 在內(nèi)的間充質(zhì)（MES）亞型與 VSIG4 表達顯著正相關(guān)，提示 VSIG4+TAMs 可能促進 GBM 向 MES 表型分化（圖 4A）。在自然條件下對惡性腫瘤細胞進行軌跡推斷分析（圖 4B），結(jié)合 CytoTRACE 干性分析結(jié)果（圖 S4A、B），發(fā)現(xiàn)腫瘤分化方向從 OPC 樣向 MES 樣轉(zhuǎn)變，表明 VSIG4+TAMs 可能促進 GBM 進展。整合 CancerSEA 的基因集，在兩個隊列中進行 ssGSEA 分析并與 VSIG4 表達進行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn) VSIG4+TAMs 的表達與腫瘤細胞的侵襲（TCGA-GBM R=0.44；CGGA-GBM R=0.62）和遷移（TCGA-GBM R=0.50；CGGA-GBM R=0.67）相關(guān)（圖 4C）。為進一步闡明 VSIG4-TAMs 對腫瘤細胞行為的作用，作者將 VSIG4-TAMs 與腫瘤細胞共培養(yǎng)以模擬 TME，CCK-8 實驗結(jié)果顯示，與 siVSIG4-TAMs 共培養(yǎng)后，腫瘤細胞系從 24 小時開始活力顯著下降（圖 4D）；劃痕愈合實驗表明，U87-MG 細胞系的遷移能力在 72 小時前略有抑制，而 U118-MG 細胞系從 48 小時開始遷移能力受到抑制（*P<0.05，雙向 ANOVA，所有實驗均進行三次獨立重復(fù)）（圖 4E）；Transwell 侵襲實驗顯示，U87-MG 細胞系和 U118-MG 細胞系與 siVSIG4-TAMs 和陰性對照 TAMs 共培養(yǎng) 72 小時后，侵襲能力均略有抑制（P<0.05，Student's t 檢驗，所有實驗均進行三次獨立重復(fù)）（圖 4F）。由此可知，作者通過對 GBM 亞型、腫瘤細胞行為的研究以及相關(guān)實驗驗證，表明抑制 TAM 中的 VSIG4 可阻礙 GBM 的遷移、侵襲和抗凋亡能力。

（五）VSIG4+S100A10+TAMs 對新輔助治療具有強抗性且表現(xiàn)出強效免疫抑制代謝特性

作者研究自然條件下 VSIG4 的免疫抑制作用時，發(fā)現(xiàn)免疫治療無應(yīng)答樣本中 VSIG4 表達高于有應(yīng)答樣本，進而探究 VSIG4+TAMs 的特定亞群是否影響免疫治療效果。利用在詳細縮放能力上優(yōu)于 t-SNE 和 UMAP 的 KNetL 圖進行分析，該圖長期用于單細胞分析和聚類，提取網(wǎng)絡(luò)布局中的節(jié)點并采用 UMAP 創(chuàng)建最終 KNetL 圖，隨后對 KNetL 圖結(jié)果進行 PhenoGraph 聚類，識別出 18 個不同的 TAM 亞群（圖 5A）。結(jié)果顯示 TAM_C15 和 TAM_C17 亞群中 VSIG4 表達極高，且 TAM_C17 主要由 Mo_TAM 組成，亞群間差異分析發(fā)現(xiàn) TAM_C17 中 S100A10 特異性表達（表 S1）。結(jié)合此前基因軌跡分析結(jié)果（圖 2E）中 VSIG4 和 S100A10 共享同一基因軌跡的發(fā)現(xiàn)，作者觀察到 S100A10 和 VSIG4 在 TAM_C17 中共定位（圖 5B、C），且它們在每個細胞中的表達呈顯著正相關(guān)（圖 S4C）。值得注意的是，與其他 TAM 亞群相比，該特定 TAM 亞群在抗 PD-1 新輔助免疫治療無應(yīng)答患者中的細胞比例最高（圖 5D）。此外，使用 miloR 算法進行組間細胞豐度分析，發(fā)現(xiàn)該亞群在有應(yīng)答和無應(yīng)答病例之間存在顯著差異，凸顯其對新輔助免疫治療的顯著抗性（圖 5E）。通過 scFEA 進行代謝分析，顯示該亞群構(gòu)成一個獨特的簇，其三羧酸循環(huán)和嘌呤合成途徑活動明顯異常（圖 5F）。將除 VSIG4+S100A10+TAM 外的其他 TAM 歸為一個統(tǒng)一組，以 Cohen's d 值作為效應(yīng)量指標(biāo)量化 VSIG4+S100A10+TAMs 的差異代謝物，發(fā)現(xiàn)在原發(fā)樣本中乳酸和乙酰輔酶 A 等代謝物上調(diào)，在復(fù)發(fā)樣本中已知可抑制炎癥細胞因子產(chǎn)生的 AICAR 和腺嘌呤上調(diào)，有應(yīng)答樣本中 2OG 和 G6P 水平升高從而增強缺氧耐受性，而在無應(yīng)答樣本中檢測到黃嘌呤和延胡索酸等代謝物，其中延胡索酸被認為是促癌代謝物（圖 5G-J）。綜上，作者通過對 TAM 亞群的鑒定和分析，證實了 VSIG4+S100A10+TAMs 對新輔助治療具有強抗性且表現(xiàn)出強效免疫抑制代謝特性。

（六）VSIG4+S100A10+TAMs 處于免疫炎癥耗竭狀態(tài)，導(dǎo)致患者預(yù)后不良

為闡明該獨特 TAM 亞群的特征，作者將其與其他歸為 Mo_TAM 和 Mg_TAM 的 TAM 進行區(qū)分以明確其獨特標(biāo)志。GSEA 分析顯示，與其他 TAM 相比，VSIG4+S100A10+TAMs 的 M2 表型富集分數(shù)最高，而 M1 表型富集分數(shù)最低（圖 6A）。干性分析表明該亞群具有旺盛的增殖能力（圖 S4D、E）。通過 AUCell 評估發(fā)現(xiàn)，該亞群中 MYC 通路活性顯著上調(diào)，同時缺氧代謝、氧化磷酸化和氧特異性反應(yīng)增強，表明其處于缺氧環(huán)境，而對抗腫瘤免疫至關(guān)重要的干擾素 -γ 信號通路和 II 類抗原呈遞則明顯受損，且該亞群還參與 DNA 損傷修復(fù)過程，顯示出較強的治療抗性和自主修復(fù)能力（圖 6B）。為評估預(yù)后意義，作者在 TCGA-GBM 和 CGGA-GBM 數(shù)據(jù)集上采用 SCISSOR 算法進行反卷積分析，該算法是通過分析來自 bulk 實驗的單細胞數(shù)據(jù)來識別與表型特征（如生存結(jié)果）關(guān)聯(lián)最強的細胞亞群的前沿方法。結(jié)果顯示，在相應(yīng)隊列中，VSIG4+S100A10+TAMs 占陽性細胞群的比例分別為 71.8% 和 64.1%，與其他細胞類型的低比例形成鮮明對比（圖 6C、D）。隨后使用 Cibersortx 進行免疫浸潤分析以確定每個樣本中的細胞類型分布，根據(jù)最佳閾值將隊列分為 VSIG4+S100A10+TAMs 高含量組和低含量組，進行對數(shù)秩生存分析，發(fā)現(xiàn) VSIG4+S100A10+TAMs 含量高的樣本與不良預(yù)后顯著相關(guān)（TCGA-GBM p=0.017；CGGA-GBM p=0.0051）（圖 6E、F）。由此可見，作者通過對 VSIG4+S100A10+TAMs 特征和預(yù)后價值的研究，證實該亞群處于免疫炎癥耗竭狀態(tài)，會導(dǎo)致患者預(yù)后不良，可作為評估 GBM 患者免疫治療效果的獨立預(yù)后生物標(biāo)志物。

（七）VSIG4+S100A10+TAMs 與 T 細胞在空間上共定位，通過細胞通訊影響 T 細胞功能

基于上述研究結(jié)果中 VSIG4+S100A10+TAMs 在免疫治療難治性患者中積累的現(xiàn)象，作者推測該亞群可能直接影響 T 細胞功能，從而降低治療效果。考慮到位置相近的細胞相互作用更強的既定原則，作者獲取來自 10X 和 Jia 等人 [16] 數(shù)據(jù)集的包含四個不同組的樣本，采用 RCTD 算法對空間樣本進行反卷積分析，以了解特定部位每種細胞類型的占比，隨后對各部位的占比分數(shù)進行相關(guān)性分析，揭示了與各種 T 細胞類型的共定位模式：在原發(fā)樣本中，VSIG4+S100A10+TAMs 與 CD4+T 細胞和增殖性 CD8+T 細胞共定位（圖 7A）；在復(fù)發(fā)樣本中，與四種 T 細胞類型共定位（圖 7B）；在有應(yīng)答病例中，與兩種 CD8+T 細胞亞群和 Treg 細胞共定位（圖 7C、S5A）；在無應(yīng)答病例中，主要與增殖性 CD8+T 細胞和 CD4+T 細胞共定位（圖 7D），且其分布與其他 TAMs 明顯不同，表明具有獨特的空間特征。為了解該亞群如何影響附近的各種 T 細胞，作者采用整合細胞間通訊預(yù)測方法和基于現(xiàn)有知識模擬細胞內(nèi)信號的計算工具的綜合策略，通過 LIANA 算法整合配體 - 受體對以及 NicheNet 的受體推斷結(jié)果。研究發(fā)現(xiàn)，VSIG4+S100A10+TAMs 主要通過 LGALS9 與 CD44/PTPRC 受體相互作用來調(diào)節(jié) CD4+T 細胞，這種相互作用促進 SMAD3 與 FOXP3 啟動子結(jié)合，有效抑制 T 細胞增殖（圖 7E）；除該相互作用軸外，還通過（CCL3/CCL2）-CCR5 軸和 S100A8-CD69 軸對 CD8+T 細胞和增殖性 CD8+T 細胞進行招募并促進其耗竭（圖 7F、G），且在多種癌癥患者中分離出的 CD8+T 細胞在耗竭的早期和晚期階段均表現(xiàn)出 CD69 基因表達上調(diào)；該亞群還通過 GRN-TNFRSF1B 和 ICAM1-IL2RG 等軸維持 Treg 細胞的免疫抑制功能（圖 7H）；此外，數(shù)據(jù)表明在無應(yīng)答者中，除增殖性 CD8+T 細胞外，IL10-CD27 軸可能是導(dǎo)致其他三種 T 細胞亞群對 PD-1 免疫治療產(chǎn)生抗性的關(guān)鍵因素。綜上，作者通過空間轉(zhuǎn)錄組分析和細胞通訊研究，明確了 VSIG4+S100A10+TAMs 與 T 細胞的空間共定位關(guān)系及其通過多種信號軸影響 T 細胞功能的機制。

（八）通過 GBM 患者的 IHC 和 mIF 驗證 VSIG4+S100A10+TAMs

為驗證 VSIG4 的表達，作者對不同臨床級別的 GBM 組織進行免疫組織化學(xué)（IHC）分析，發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā) GBM 中 VSIG4 的表達高于原發(fā) GBM（圖 8A）和低級別膠質(zhì)瘤（圖 S5B、C），這一結(jié)果證實了此前關(guān)于 TAMs 中 VSIG4 上調(diào)的結(jié)論，也與復(fù)發(fā) GBM 中 Mo_TAM 增加且 VSIG4 表達升高的情況一致。作者進一步研究了 TAM 中 VSIG4 和 S100A10 的共表達，以及 M2 樣 TAM 的公認標(biāo)志物 CD206，還有它們在 TME 中與 T 細胞的潛在空間相互作用。通過對原發(fā)和復(fù)發(fā) GBM 組織進行多重免疫熒光（mIF）檢測，作者觀察到 VSIG4+S100A10+TAMs 的共定位（圖 8B、D），同時熒光成像顯示它們與 T 細胞鄰近（圖 8C），這一結(jié)果證實了空間轉(zhuǎn)錄組分析的結(jié)論。綜上所述，作者通過臨床樣本的 IHC 和 mIF 實驗，進一步驗證了 VSIG4+S100A10+TAMs 在 GBM-TME 中的存在及其與 T 細胞的空間關(guān)聯(lián)，強調(diào)了該 TAM 亞群的重要性。

（九）VSIG4+S100A10+TAMs 在 GBM 微環(huán)境中的作用及潛在功能總結(jié)

作者通過綜合分析，繪制出 VSIG4+S100A10+TAMs 在 GBM 微環(huán)境中的作用機制圖（圖 9）。圖中展示了單核細胞被招募后分化為 M1 樣 TAMs 和 M2 樣 TAMs，其中 VSIG4 和 S100A10 在相關(guān)細胞中表達，且該亞群處于缺氧環(huán)境，MHC II 類分子表達受影響，IFN-γ 信號通路受損，同時參與 DNA 修復(fù)過程；在代謝方面，該亞群涉及糖酵解、三羧酸循環(huán)和嘌呤合成等過程；惡性腫瘤細胞與 GBM-TAMs 之間存在相互作用，VSIG4+S100A10+TAMs 可抑制 T 細胞功能，影響免疫檢查點阻斷（ICB）治療效果，而 PD-1 阻斷治療對其作用有限?？傊搱D清晰地總結(jié)了 VSIG4+S100A10+TAMs 在 GBM 微環(huán)境中促進免疫抑制、影響腫瘤進展和免疫治療效果的潛在功能及作用途徑。

本研究圍繞膠質(zhì)母細胞瘤（GBM）的腫瘤免疫微環(huán)境（TIME）展開，通過整合 bulk RNA 測序、單細胞 RNA 測序（scRNA-seq）、空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)等多組學(xué)技術(shù)，結(jié)合流式細胞術(shù)、細胞共培養(yǎng)、免疫組織化學(xué)（IHC）、多重免疫熒光（mIF）等實驗方法，深入探究了 VSIG4+S100A10 + 腫瘤相關(guān)巨噬細胞（TAMs）在 GBM 免疫抑制及抗 PD-1 免疫治療中的作用。研究首先發(fā)現(xiàn) VSIG4 在 TAMs 中高表達且與免疫抑制性微環(huán)境呈正相關(guān)，其表達隨 TAMs 分化逐漸上調(diào)，并能促進 TAMs 向 M2 型極化，進而推動 GBM 進展；隨后鑒定出 VSIG4+S100A10+TAMs 這一獨特 TAM 亞群，該亞群在免疫治療無應(yīng)答患者中大量聚集，對新輔助治療具有強抗性，表現(xiàn)出缺氧、高增殖、炎癥耗竭的特征及異常代謝模式，且與 T 細胞在空間上共定位，通過多種信號軸抑制 T 細胞免疫功能；同時證實該亞群是 GBM 患者不良預(yù)后的獨立預(yù)測指標(biāo)，可作為潛在的預(yù)后生物標(biāo)志物和治療靶點。此外，研究還提出將 PD-1 阻斷與選擇性抑制 VSIG4+S100A10+TAMs 相結(jié)合的雙靶點治療策略，為改善 GBM 患者對現(xiàn)有免疫治療的應(yīng)答提供了新的思路和實驗依據(jù)，盡管研究存在缺乏免疫治療后縱向樣本及體內(nèi)驗證等局限性，但仍為 GBM 免疫治療領(lǐng)域的發(fā)展奠定了重要基礎(chǔ)。