熒光分析法

光致發(fā)光：有些物質(zhì)受到光照射時(shí)，除吸收某種波長(zhǎng)的光之外，還會(huì)發(fā)射出比原來所吸收光的波長(zhǎng)更長(zhǎng)的光

特點(diǎn)：靈敏度高，選擇性好，檢測(cè)限低于紫外-可見分光光度法

分為：紫外-可見熒光、紅外熒光、X射線熒光

第一節(jié)：熒光分析法的基本原理

分子熒光

分子熒光的產(chǎn)生

分子的電子能級(jí)與激發(fā)過程：分子的基態(tài)、激發(fā)單重態(tài)S、激發(fā)三重態(tài)T

熒光產(chǎn)生：

1. 振動(dòng)弛豫：處于激發(fā)態(tài)各振動(dòng)能級(jí)的分子是通過與溶劑分子的碰撞而將部分振動(dòng)能量傳遞給溶劑分子，其電子則返回到同一電子激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)的過程；無輻射躍遷、只能在同一電子能級(jí)內(nèi)進(jìn)行
2. 內(nèi)部能量轉(zhuǎn)換（內(nèi)轉(zhuǎn)換）：當(dāng)兩個(gè)電子激發(fā)態(tài)之間的能量相差較少時(shí)以致其振動(dòng)能級(jí)有重疊時(shí)，受激分子常由高電子能級(jí)以無輻射方式轉(zhuǎn)移至低電子能級(jí)的過程
3. 熒光發(fā)射：激發(fā)單重態(tài)最低振動(dòng)能級(jí)的分子以輻射的形式發(fā)射光量子至基態(tài)的任一振動(dòng)能級(jí)上
4. 外部能量轉(zhuǎn)換（外轉(zhuǎn)換）：溶液中激發(fā)態(tài)分子與溶劑分子或與其他溶質(zhì)分子之間相互碰撞而失去能量，以熱能的形式釋放能量的過程，常發(fā)生在激發(fā)態(tài)最低振動(dòng)能級(jí)向基態(tài)轉(zhuǎn)換，外轉(zhuǎn)換降低熒光強(qiáng)度
5. 體系間跨越：處于激發(fā)態(tài)分子的電子發(fā)生自旋反轉(zhuǎn)而使分子的多重性發(fā)生變化的過程，降低熒光強(qiáng)度，甚至熄滅；含重原子的分子，體系間跨越最常見；溶液中存在氧分子等順磁性分子時(shí)也容易發(fā)生體系間跨越
6. 磷光發(fā)射：分子在激發(fā)三重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)可以存活一段時(shí)間，然后返回至基態(tài)各個(gè)振動(dòng)能級(jí)而發(fā)出光輻射，這種輻射稱為磷光。波長(zhǎng)更長(zhǎng)，壽命長(zhǎng)，因此三重態(tài)分子常以無輻射方式返回基態(tài)，因此室溫下很少呈現(xiàn)磷光，一般需要冷凍或固定化

熒光的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜

激發(fā)光譜：不同激發(fā)波長(zhǎng)的輻射引起物質(zhì)發(fā)射某一波長(zhǎng)熒光的相對(duì)強(qiáng)度（檢測(cè)的熒光波長(zhǎng)不變）

熒光光譜：表示在所發(fā)射熒光中各種波長(zhǎng)組分的相對(duì)強(qiáng)度（激發(fā)波長(zhǎng)不變）

溶液熒光光譜的特征：

1. 斯托克斯位移：熒光發(fā)射波長(zhǎng)總是大于激發(fā)波長(zhǎng)，內(nèi)轉(zhuǎn)換和振動(dòng)弛豫及熒光發(fā)射返回到基態(tài)各個(gè)能級(jí)
2. 熒光光譜的形狀與激發(fā)波長(zhǎng)無關(guān)：熒光光譜只有一個(gè)發(fā)射帶
3. 熒光光譜與激發(fā)光譜的鏡像關(guān)系：激發(fā)光譜與熒光光譜的形狀相似，而且兩者間存在鏡像對(duì)稱關(guān)系

熒光與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系

熒光壽命和熒光效率

熒光壽命：當(dāng)除去激發(fā)光源后，分子的熒光強(qiáng)度降低到最大熒光強(qiáng)度的1/e所需的時(shí)間用表示

利用分子熒光壽命差別可以進(jìn)行熒光物質(zhì)混合物的分析

熒光效率：執(zhí)法態(tài)分子發(fā)射熒光的光子數(shù)與幾臺(tái)分子吸收激發(fā)光的光子數(shù)，用表示

有機(jī)化合物分子結(jié)構(gòu)與熒光的關(guān)系

發(fā)射熒光條件：強(qiáng)的紫外可見吸收；一定的熒光效率

一般長(zhǎng)共軛分子具有較強(qiáng)紫外吸收，剛性分子平面具有較高的熒光效率

本來不發(fā)生熒光或熒光較弱的物質(zhì)與金屬離子形成配位化合物后，如果剛性和共平面性增加那么就可以發(fā)射熒光或增強(qiáng)熒光，位阻效應(yīng)導(dǎo)致的共平面性下降則熒光減弱，對(duì)于順反異構(gòu)體，反式空間位阻小，共平面性大，熒光強(qiáng)

增加π電子的取代基使熒光加強(qiáng)，一般為給電子取代基；減弱π電子共軛的使熒光減弱甚至熄滅，一般為吸電子取代基；還有對(duì)π電子共軛影響較小的取代基對(duì)熒光影響不大

熒光試劑

1. 熒光胺：脂肪族和芳香族伯胺
2. 鄰苯二甲醛（OPA）：伯胺，脯氨酸及羥脯氨酸以外的氨基酸
3. 1-二甲氨基-5-氯化磺酰萘（丹酰氯）：伯胺、仲胺、酚基
4. 測(cè)定無機(jī)離子的熒光試劑：

影響熒光強(qiáng)度的外部因素

1. 溫度：一般隨溫度升高熒光強(qiáng)度降低
2. 溶劑：一般熒光波長(zhǎng)隨溶劑極性增強(qiáng)而長(zhǎng)移，熒光強(qiáng)度也增強(qiáng)，溶劑黏度越低，熒光越弱
3. 酸度：酸度影響溶劑中分子的存在形式從而影響熒光強(qiáng)度
4. 熒光熄滅劑：熒光物質(zhì)分子與溶劑分子或其他溶質(zhì)分子相互作用引起熒光強(qiáng)度降低的現(xiàn)象，如鹵素、重金屬離子、氧分子及硝基化合物、重氮化合物、羰基、羧基化合物。熒光熄滅原因：熒光物質(zhì)的分子與熄滅劑分子碰撞損失能量；熒光物質(zhì)的分子與熄滅劑作用而生成本身不發(fā)光的物質(zhì)；溶解氧的存在；濃度較大發(fā)生自熄滅現(xiàn)象。熒光熄滅法（如果一個(gè)熒光物質(zhì)在加入某種熄滅劑后，熒光強(qiáng)度的減弱和熒光熄滅劑的濃度呈線性關(guān)系）
5. 散射光：
   1. 瑞利散射：
   2. 拉曼散射：影響較大，必須消除，選用適當(dāng)?shù)募ぐl(fā)波長(zhǎng)可以消除拉曼光散射

第二節(jié)：熒光定量分析方法

溶液熒光強(qiáng)度與物質(zhì)濃度的關(guān)系

低濃度（）時(shí)，溶液的熒光強(qiáng)度與溶液中熒光物質(zhì)的濃度呈線性關(guān)系

熒光定量分析方法

1. 工作曲線法：與紫外-可見分光光度法不同的是，在繪制工作曲線時(shí)，常采用系列中某一對(duì)照品溶液作為基準(zhǔn)，將空白溶液的熒光強(qiáng)度讀數(shù)調(diào)至0，將該對(duì)照品溶液的熒光強(qiáng)度讀數(shù)調(diào)至100%或50%，然后測(cè)定其他各個(gè)對(duì)照品溶液的熒光強(qiáng)度
2. 比例法：工作曲線通過原點(diǎn)或者扣除空白溶液的熒光強(qiáng)度
3. 聯(lián)立方程法：用于多組分混合物的熒光分析

第三節(jié)：熒光分光光度計(jì)和熒光分析技術(shù)

熒光分光光度計(jì)

• 濾光片熒光計(jì)：不能測(cè)定光譜，只能定量分析
• 濾光片-單色器熒光計(jì)：將發(fā)射濾光片用光柵代替，不能測(cè)激發(fā)光譜，但能測(cè)熒光光譜
• 熒光分光光度計(jì)：將兩個(gè)濾光片都用光柵替代，可以繪制光譜

1. 熒光分光光度計(jì)主要部件：激發(fā)光源（氘燈）、激發(fā)單色器、發(fā)射單色器、樣品池、監(jiān)測(cè)系統(tǒng)
2. 儀器校正：
   1. 靈敏度校正：常用1 的硫酸奎寧對(duì)照品溶液0.05 mol/L（硫酸中）
   2. 波長(zhǎng)校正：用汞燈的標(biāo)準(zhǔn)譜線對(duì)單色器波長(zhǎng)刻度進(jìn)行校正
   3. 激發(fā)光譜和熒光光譜的校正：由于光源強(qiáng)度隨波長(zhǎng)而變；每個(gè)檢測(cè)器對(duì)不同波長(zhǎng)光接受程度不同；檢測(cè)器的感應(yīng)與波長(zhǎng)不呈線性

其他熒光分析技術(shù)

1. 激光誘導(dǎo)熒光分析：激光作為光源，靈敏度更高
2. 時(shí)間分辨熒光分析：利用不同物質(zhì)的熒光壽命不同，在激發(fā)和檢測(cè)之間延緩時(shí)間不同進(jìn)行選擇性檢測(cè)，應(yīng)用于免疫分析
3. 同步熒光分析：在熒光物質(zhì)的激發(fā)光譜和熒光光譜中選擇一適宜的波長(zhǎng)差，同時(shí)掃描發(fā)射波長(zhǎng)和激發(fā)波長(zhǎng)
4. 膠束增敏熒光分析：減弱碰撞，減少無輻射躍遷；降低熒光熄滅劑作用；降低熒光物質(zhì)自熄滅