???????轉(zhuǎn)眼間，暑假已經(jīng)過半，我們的實(shí)驗(yàn)工作也已經(jīng)開展了半個(gè)多月了！大家肯定會(huì)很好奇，在這短短半個(gè)月中，我們都完成了什么。那么今天，就跟著我們一起看看我們都完成了什么工作吧！
???????首先是項(xiàng)目的背景調(diào)查。詳細(xì)內(nèi)容可以去看我們上一篇文章哦！
???????在確定了主題是改造解脂耶氏酵母，使它可以利用陳化糧制造生物柴油之后，我們便開始了設(shè)計(jì)bio-Brick，將我們所要的基因片段從其他細(xì)胞中提取出來，統(tǒng)一使片段具有統(tǒng)一的組裝接口。然后就可以像積木一樣簡(jiǎn)單地組裝了。
???????在我們的項(xiàng)目里，總共設(shè)計(jì)了7個(gè)bio-Brick，分別是兩個(gè)promoter（啟動(dòng)子，用來啟動(dòng)基因片段的表達(dá)），兩個(gè)terminator（終止子，用來終止基因表達(dá)），兩個(gè)基因片段（分別表現(xiàn)為分解淀粉和葡萄糖），和一個(gè)篩選基因（用來篩選出成功轉(zhuǎn)化遺傳基因的細(xì)胞）。為了要多次試驗(yàn)提高成功率，降低成本，我們采用了PCR技術(shù)，以擴(kuò)增我們所要的基因片段。
PCR技術(shù)是什么？
PCR技術(shù)，又稱聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。是一種用于放大擴(kuò)增特定的DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)，它可看作是生物體外的特殊DNA復(fù)制。PCR的最大特點(diǎn)，也是最神奇的一點(diǎn)，是可以將微量的DNA大幅增加（比如遠(yuǎn)古生物的DNA，哪怕只有一點(diǎn)點(diǎn)，通過PCR技術(shù)也可以將其大量擴(kuò)增，進(jìn)行對(duì)比）。（*參考百度百科）
PCR技術(shù)的原理是什么？
簡(jiǎn)單來說，就是體外模擬生物體的DNA復(fù)制
而整個(gè)程序分為四個(gè)階段：預(yù)變性、變性、退火、延伸?
（1）&（2）DNA雙鏈在高溫下完全解旋，變成單鏈DNA（預(yù)變性&變性）
（3） 引物結(jié)合在單鏈DNA上（退火）
（4） 在DNA聚合酶存在下，向外延長(zhǎng)，最后合成目的片段（延伸）
在完成了PCR擴(kuò)增后，我們就要開始驗(yàn)證所得DNA條帶是否是我們需要的目的條帶，大小是否正確。這里是我們主要完成的工作的第二個(gè)部分—瓊脂糖凝膠電泳，簡(jiǎn)稱跑膠
跑膠用到的材料有：瓊脂糖，TAE緩沖液，核酸染料，Buffer，DNA marker
跑膠過程（大致）：
（1） 配膠：取一定量的瓊脂糖于500 mL容量的三角瓶中，并加入TAE緩沖液，于微波爐中進(jìn)行加熱，使得瓊脂糖全部溶解。
（2） 加入核酸染料，搖晃均勻。溶解液倒入插入梳子的膠盒，等待直到膠凝固。
（3） 膠輕輕放入電泳槽，并使TAE將膠完全浸沒。
（4） 點(diǎn)樣：取PCR溶液，加入Buffer，混勻后點(diǎn)入膠孔。同時(shí)在膠孔點(diǎn)入一個(gè)marker做驗(yàn)證。
（5） 打開電泳槽開關(guān)，30min后關(guān)閉電泳槽。
（6） 把膠拿到紫外下進(jìn)行照射。驗(yàn)證條帶大小。
那么跑膠的原理又是什么呢？
首先，讓我從原料來給大家普及下吧！
瓊脂糖凝膠，以瓊脂糖為支持介質(zhì)制備的凝膠。最早被人們?cè)谝环N藻類中發(fā)現(xiàn)，并成功提取。這種材料非常神奇，在電場(chǎng)作用下能產(chǎn)生較強(qiáng)的電滲現(xiàn)象，加之硫酸根可與某些蛋白質(zhì)作用而影響電泳速度及分離效果。
*電滲現(xiàn)象：由于瓊脂糖凝膠為多孔狀，不帶電荷，而其中的溶液在電場(chǎng)之中相對(duì)帶電，溶液會(huì)向一邊滲透。
TAE緩沖液、Buffer，都為緩沖劑，使溶液帶電
核酸染料可以使最終的跑膠結(jié)果在紫外線下呈現(xiàn)
DNA marker：作為跑膠的對(duì)照，判斷最終的DNA條帶的大小是否正確。
跑膠的“核心”原理：由于瓊脂糖凝膠具有網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，物質(zhì)分子通過時(shí)會(huì)受到阻力，（大分子物質(zhì)在涌動(dòng)時(shí)受到的阻力大，小分子所受阻力?。┮虼嗽谀z電泳中，帶電顆粒的分離不僅取決于凈電荷的性質(zhì)和數(shù)量，而且還取決于分子大小，這就大大提高了分辨能力；同時(shí)，蛋白質(zhì)和核酸會(huì)根據(jù)pH不同帶有不同電荷，在電場(chǎng)中受力大小不同，因此跑的速度不同，根據(jù)這個(gè)原理可將其分開。
最后，我們將電泳完畢的膠塊放置紫外燈下，由于膠和要驗(yàn)證的PCR產(chǎn)物中都加入了染料，故最后呈現(xiàn)出來的樣子：（其中對(duì)照中不滴加任何模板，故沒有條帶）
以上就是我們兩周來主要做的實(shí)驗(yàn)！
/其實(shí)，to be honest，我們一直在重復(fù)提取bio-Brick中的兩個(gè)基因片段。提取時(shí)，一直無法提取到正確排序的片段（如，最近的一次，金屬離子基本合格，可在測(cè)序時(shí)發(fā)現(xiàn)排序出現(xiàn)了變異）...
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