EPIC
https://gfellerlab.shinyapps.io/EPIC_1-1/
EPIC可根據(jù)表達(dá)數(shù)據(jù)分析出8種免疫細(xì)胞的浸潤比例，分別是：B細(xì)胞、 腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAFs）、CD4+T細(xì)胞、 CD8+T細(xì)胞、 內(nèi)皮細(xì)胞、 巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞。
其中，CAFs是腫瘤微環(huán)境的重要組成部分，有抑制免疫細(xì)胞的功能。可通過分泌生長因子如血管內(nèi)皮生長因子、血小板衍生因子或其他趨化因子促進(jìn)腫瘤生長和轉(zhuǎn)移。
重要的是，這個(gè)工具的使用方法相當(dāng)簡單粗暴，只需要3步:
1. 提交RNA-Seq表達(dá)數(shù)據(jù)；
2. 設(shè)置參數(shù)
2.1 選擇參考配置文件：血液細(xì)胞或腫瘤浸潤細(xì)胞
2.2 選擇結(jié)果類型：細(xì)胞比例（Cell Fractions）或mRNA比例（mRNA Fractions）
3. 每次運(yùn)行添加個(gè)任務(wù)名字（Job name），點(diǎn)擊Run EPIC。
Run結(jié)束后，網(wǎng)站提供結(jié)果的table和figures展示，也提供結(jié)果的下載。在table里，同時(shí)提供檢索框，可直接查詢感興趣的檢索結(jié)果。
研究者可以直接在運(yùn)行結(jié)果后分析各種細(xì)胞組分在樣本中的差異，當(dāng)B細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、NK細(xì)胞比例顯著下降時(shí)，表明組織中的免疫反應(yīng)被抑制了，免疫細(xì)胞的招募過程受到阻礙，腫瘤免疫受到抑制；相反，CAF的增高則與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。
CIBERSORT
https://cibersort.stanford.edu/
這是目前引用次數(shù)最多的免疫細(xì)胞浸潤估計(jì)分析工具，2015年首次發(fā)表于Nature method。
CIBERSORT是基于線性支持向量回歸的原理對(duì)免疫細(xì)胞亞型的表達(dá)矩陣進(jìn)行去卷積的一個(gè)工具，可用RNA-Seq的數(shù)據(jù)來估計(jì)免疫細(xì)胞浸潤情況，目前為止只提供網(wǎng)頁版。
用戶只需要注冊一個(gè)賬號(hào)，就可獲得500M存儲(chǔ)數(shù)據(jù)和結(jié)果的空間。操作時(shí)，只需上傳標(biāo)準(zhǔn)的表達(dá)矩陣文件即可分析免疫浸潤；如果想要分析包含其他細(xì)胞類型的浸潤比例，則需按照官網(wǎng)提示的格式上傳相應(yīng)的文件。
在所有需要用戶提交的參數(shù)和文件里，下圖是最重要的
首先，工具提供“相對(duì)模式”和“絕對(duì)模式”。相對(duì)模式是指所有的免疫細(xì)胞的浸潤比例分?jǐn)?shù)之和為1，而絕對(duì)模式是指每種免疫細(xì)胞浸潤的絕對(duì)分?jǐn)?shù)。
默認(rèn)情況下，工具只運(yùn)行相對(duì)模式，當(dāng)用戶勾選絕對(duì)模式時(shí)，則先計(jì)算絕對(duì)模式，再根據(jù)絕對(duì)模式的結(jié)果計(jì)算相對(duì)分?jǐn)?shù)，而這個(gè)相對(duì)分?jǐn)?shù)的結(jié)果可能與只運(yùn)行相對(duì)模式的結(jié)果存在偏差。
當(dāng)這兩個(gè)結(jié)果存在明顯偏差時(shí)，用戶應(yīng)該取消同時(shí)運(yùn)行絕對(duì)模式和相對(duì)模式。考慮到目前絕對(duì)模式的算法尚不成熟還處于測試階段，個(gè)人建議直接運(yùn)行相對(duì)模式比較穩(wěn)妥，結(jié)果的可靠性相對(duì)更高。
其他的參數(shù)選項(xiàng)都用默認(rèn)的即可，再添加一個(gè)“Name for custom sig file”的名稱，有助于識(shí)別每次運(yùn)行的工作內(nèi)容。各項(xiàng)參數(shù)提交后，選擇“Run”開始計(jì)算。最后的計(jì)算結(jié)果，可以在Menu的Job Results欄查看。用戶可以重新run結(jié)果或者下載結(jié)果。
用戶點(diǎn)擊Actions里的九宮格按鍵，可以查看熱圖形式展示的結(jié)果。
至于結(jié)果的分析也就比較常規(guī)了，一般而言都是以不同特征分組然后比較，如比較正常和腫瘤組織中的免疫浸潤差異，也可以比較有無某種基因突變的樣本間免疫浸潤的差異。
說到這里，也需要提醒大家，免疫細(xì)胞的浸潤其實(shí)是一個(gè)未知的狀態(tài)，測序時(shí)的組織樣本是很多種細(xì)胞的混合物，不同的軟件基于不同的算法，計(jì)算出來的結(jié)果之間存在一些偏差是再正常不過了的事情，至于誰的更準(zhǔn)確一些，目前為止仍然是一個(gè)不可證偽的事情，所以在選擇工具的時(shí)候就仁者見仁智者見智啦。
