理論知識：
組織是由不同譜系和亞型的細(xì)胞類型組成的復(fù)雜環(huán)境，每種細(xì)胞都有自己獨(dú)特的轉(zhuǎn)錄組。因此，批量轉(zhuǎn)錄組分析是細(xì)胞類型特異性基因表達(dá)的總和加權(quán)的細(xì)胞類型比例在給定的樣本。去卷積的基因表達(dá)譜允許重建組織的細(xì)胞組成。Xcell 是一個強(qiáng)大的計(jì)算方法，轉(zhuǎn)換基因表達(dá)譜為豐富分?jǐn)?shù)的64免疫和基質(zhì)細(xì)胞類型跨樣本。
不同受試者細(xì)胞類型組成的差異可以確定疾病的細(xì)胞靶點(diǎn)，并提出新的治療策略。此外，調(diào)整這些變異可以檢測真正的基因表達(dá)差異，并提高解釋下游分析。
1.安裝xCell
Xcell 是在 r 中開發(fā)的，用于運(yùn)行 xcell 的 r 包可以作為 github 存儲庫中的開源代碼使用 (https://github.com/dviraran/xCell)
安裝 r 是一個先決條件(https://www.r-project.org/) ，rstudio 是運(yùn)行 r 腳本的推薦環(huán)境(https://www.rstudio.com/)。
要安裝 xcell r 包，下面的所有命令都應(yīng)該在 r 環(huán)境中輸入:
如果 devtools 包以前沒有安裝，首先安裝它:
install.packages('devtools')
從 github 安裝當(dāng)前的 xcell 版本:
devtools::install_github('dviraran/xCell')
Xcell 包裝依賴于以下包裝: 生物導(dǎo)體包裝ーGSVA，GSEABase。
if (!requireNamespace("BiocManager", quietly = TRUE))
install.packages("BiocManager")
BiocManager::install(c("GSVA","GSEABase"), version = "3.8")
CRAN packages—pracma, utils, stats, MASS, digest, curl,
quadprog.
install.packages('pracma', 'utils', ' stats', 'MASS',
'digest', 'curl', 'quadprog')
以上為xCell說明文檔的安裝說明，以下為網(wǎng)絡(luò)上的方法（用以下即可）。
install.packages('Rcpp') #########安裝各類程序包
devtools::install_github('dviraran/xCell')
library(xCell)
2.輸入文件
文件格式：Xcell 的輸入是來自人類混合樣本的基因表達(dá)矩陣。應(yīng)該在運(yùn)行 xcell 函數(shù)之前讀取它。矩陣應(yīng)該是基因作為行名，列是樣本。如果基因表達(dá)式是一個標(biāo)簽分隔的文件，可以使用下面的調(diào)用來讀取它:
expr = read.table(file.name, header=TRUE, row.names=1, as.is=TRUE, sep='\t')
如果基因表達(dá)數(shù)據(jù)來自微陣列，就不需要標(biāo)準(zhǔn)化。如果基因表達(dá)數(shù)據(jù)來自一個測序平臺，數(shù)值必須被歸一化為基因長度(例如，rpkm，tpm，fpkm)。Xcell 使用表達(dá)式級別排序，而不使用實(shí)際值，因此進(jìn)一步的規(guī)范化不會產(chǎn)生影響。
3.xCell Pipeline
Xcell 管道由三個步驟組成，它們在 r 包中也表示為函數(shù):
1. rawEnrichmentAnalysis
xCell.data$genes
作為最低要求，輸入基因表達(dá)矩陣至少需要5000個基因，但共用基因數(shù)目太少可能會影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。
Xcell 為每種單元格類型使用多個簽名?？偣灿?89個特征符合64種細(xì)胞類型。完整的簽名列表可在以下網(wǎng)址找到:
xCell.data$signatures
得分計(jì)算使用單樣本基因集富集分析(ssGSVA)。對于每個單元格類型，計(jì)算來自多個相應(yīng)簽名的多個得分的平均值。最后，平均分?jǐn)?shù)被移動，使得每個單元格類型的最小分?jǐn)?shù)為零。
scores = rawEnrichmentAnalysis(expr, signatures,
genes, file.name, parallel.sz, parallel.type = "SOCK")
2. transformScores
這個函數(shù)用于將得分從原始濃縮得分轉(zhuǎn)換為類似百分比的線性尺度，xcell 使用預(yù)先計(jì)算的校準(zhǔn)參數(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)換。Xcell 使用不同的參數(shù)設(shè)置基于序列的基因表達(dá)值和基于微陣列的值(有關(guān)調(diào)整校準(zhǔn)參數(shù)的信息，請參閱注3)。基于序列的值的參數(shù)可以在下面找到:
xCell.data$spill$fv
對于基于微陣列的數(shù)據(jù):
xCell.data$spill.array$fv
函數(shù)的用法如下:
tscores = transformScores(scores, fit.vals, scale, fn)
‘scores’是 rawenrichmentanalysis 的輸出; ‘ fit.vals’是上面描述的校準(zhǔn)參數(shù); 如果符合邏輯，則是否按比例縮放轉(zhuǎn)換后的分?jǐn)?shù)(默認(rèn)值為 true 并推薦使用)。
3. spillOver
spillOver(transformedScores, K, alpha = 0.5, file.name = NULL)
usage
xCellAnalysis(expr, signatures = NULL, genes = NULL, spill= NULL, rnaseq = TRUE, file.name = NULL, scale = TRUE, alpha =0.5, save.raw = FALSE, parallel.sz = 4, parallel.type = "SOCK",cell.types.use =NULL)
可簡化為
exprMatrix = read.table("expr",header=TRUE,row.names=1, as.is=TRUE)
4.實(shí)例
1）輸入樣本
在https://github.com/dviraran/xCell/tree/master/vignettes
sdy = readRDS('sdy420.rds')
sdy有兩種數(shù)據(jù)，一種是表達(dá)譜，另一種是細(xì)胞分?jǐn)?shù)。
raw.scores = rawEnrichmentAnalysis(as.matrix(sdy$expr),
xCell.data$signatures,
xCell.data$genes) #首先生成原始分?jǐn)?shù)
下一步是轉(zhuǎn)換原始分?jǐn)?shù)，并應(yīng)用溢出補(bǔ)償。為了獲得最佳的結(jié)果，最好只對相關(guān)的細(xì)胞類型進(jìn)行溢出補(bǔ)償（例如，如果我們知道混合物中沒有巨噬細(xì)胞，最好將它們從分析中去除）。因此，我們將分?jǐn)?shù)矩陣子集為僅在CyTOF數(shù)據(jù)集中也被測量的單元格類型：
cell.types.use = intersect(colnames(xCell.data$spill$K),
rownames(sdy$fcs))
最后一步是補(bǔ)償溢出效果的分?jǐn)?shù)：
scores = spillOver(transformed.scores,xCell.data$spill.array$K)
請注意，我們在這里使用xCell.data$spill.array數(shù)據(jù)，因?yàn)楸磉_(dá)式數(shù)據(jù)是用微陣列生成的。上面詳細(xì)介紹的管道也可以使用xCell分析包裝器功能同樣執(zhí)行：
scores = xCellAnalysis(sdy$expr, rnaseq=F,cell.types.use = cell.types.use)
使用這些分?jǐn)?shù)，我們現(xiàn)在可以找到細(xì)胞分?jǐn)?shù)和細(xì)胞類型分?jǐn)?shù)之間的相關(guān)性:
library(psych)
library(ggplot2)
fcs = sdy$fcs[rownames(scores),colnames(scores)]
res = corr.test(t(scores),t(fcs),adjust='none')
qplot(x=rownames(res$r),y=diag(res$r),
fill=diag(res$p)<0.05,geom='col',
main = 'SDY420 asspciation with immunoprofiling',
ylab = 'Pearson R')+labs(fill="p-value<0.05")+
theme_classic()+
theme(axis.text.x = element_text(angle = 45,hjust = 1))
該代碼生成一個條形圖（圖1a），用于顯示xCell分?jǐn)?shù)與免疫分析的預(yù)期分?jǐn)?shù)的相關(guān)性。我們發(fā)現(xiàn)18種細(xì)胞類型中的13種存在顯著相關(guān)性(p值<0.05)，7種細(xì)胞類型中存在高相關(guān)性(R>0.5)。需要注意的是，xCell產(chǎn)生的是富集分?jǐn)?shù)，而不是細(xì)胞類型的比例，因此不期望分?jǐn)?shù)會與CyTOF比例相似，只是測量值之間將存在線性相關(guān)。
在上面的分析中，我們使用一個細(xì)胞子集運(yùn)行了xCell，而不是所有64種細(xì)胞類型。在某些情況下，這可能會提高準(zhǔn)確性，因?yàn)橐绯鲅a(bǔ)償程序可能會進(jìn)行過度補(bǔ)償。因此，我們可以對所有細(xì)胞類型進(jìn)行相同的分析，并與免疫圖譜分析進(jìn)行關(guān)聯(lián)：
