2022年6月22日，解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心劉兵團(tuán)隊(duì)和北京大學(xué)人民醫(yī)院黃曉軍團(tuán)隊(duì)在Cell Discovery雜志發(fā)表了題為Decoding lymphomyeloid divergence and immune hyp?oresponsiveness in G-CSF-primed human bone marrow by single-cell RNA-seq的研究論文。本研究首次在單細(xì)胞分辨率上對(duì)G-CSF刺激前后的人骨髓轉(zhuǎn)錄組圖譜進(jìn)行了解析，探究了G-CSF誘導(dǎo)骨髓造血分化偏倚和T/NK細(xì)胞免疫低反應(yīng)性的潛在機(jī)制。

研究背景

異基因造血干細(xì)胞移植（allogeneic hematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT）是目前血液系統(tǒng)惡性腫瘤的有效治療手段，但移植后合并癥移植物抗宿主疾?。℅raft-versus-host disease，GVHD）是造成移植后患者死亡的主要原因之一。?粒細(xì)胞集落刺激因子?（granulocyte colony-stimulating factor,?G-CSF?）是臨床上廣泛應(yīng)用的造血干細(xì)胞動(dòng)員劑, 可通過(guò)免疫調(diào)節(jié)作用降低急性GVHD的發(fā)生率，而不影響移植物抗白血病效應(yīng)?。此外，研究表明G-CSF動(dòng)員的骨髓（G-BM）移植具有與G-CSF動(dòng)員的外周血干細(xì)胞移植相當(dāng)?shù)闹踩胄Ч洼^低的GVHD風(fēng)險(xiǎn)，提示G-BM有獨(dú)特的免疫調(diào)節(jié)特性。然而，迄今為止仍未精確解析G-CSF影響人骨髓造血分化及誘導(dǎo)免疫耐受的機(jī)制。

?研究路線

主要結(jié)果

G-CSF治療后人骨髓造血細(xì)胞的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析

為了生成G-BM中細(xì)胞的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖，在G-CSF處理5天前后分別從2名健康供體中收集了BM樣本，并使用熒光激活細(xì)胞分選(FACS)分離不同的細(xì)胞系，經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的質(zhì)量控制，從2個(gè)供體的4個(gè)BM樣本中共獲得21,005個(gè)細(xì)胞，并進(jìn)一步劃分為5個(gè)細(xì)胞系將其定義為HSPC，髓系，T/NK譜系，B譜系和紅/巨核細(xì)胞系(EM_lineage)。并且發(fā)現(xiàn)，G-CSF治療導(dǎo)致HSPC和髓系比例增加，而T/NK系比例下降，表明G-BM的造血偏向于髓系。骨髓造血相關(guān)基因LYZ、S100A8、S100A9表達(dá)增加，T細(xì)胞分化相關(guān)基因CD3D、TRAC、IFITM1表達(dá)降低也支持了這一發(fā)現(xiàn)。

G-BM的骨髓偏向造血分化

根據(jù)細(xì)胞類型相關(guān)基因的表達(dá)將鑒定出的HSPC重新聚類為9個(gè)亞群并且發(fā)現(xiàn)所有這些細(xì)胞在接受CSF刺激后細(xì)胞百分比均增加。進(jìn)一步計(jì)算了HSPC中的相對(duì)細(xì)胞比例發(fā)現(xiàn)：人G-BM中同樣存在淋髓造血分化的偏倚，即林系祖細(xì)胞包括共同淋系祖細(xì)胞（common lymphoid progenitor, CLP）和祖B細(xì)胞（progenitor B cell, Pro-B）的相對(duì)比例下調(diào)，而髓系祖細(xì)胞粒-單核祖細(xì)胞（granulocyte-monocyte progenitor，GMP）的比例顯著上調(diào)，通過(guò)結(jié)合造血干祖細(xì)胞中細(xì)胞組成變化和淋髓分化軌跡分析，首次推測(cè)G-CSF誘導(dǎo)人骨髓造血淋髓偏倚最早發(fā)生在淋系傾向多潛能祖細(xì)胞（lymphoid-primed multipotent progenitor，LMPP）水平。

G-CSF給藥前后BM中T/NK譜系亞聚類

為了進(jìn)一步評(píng)估G-CSF對(duì)免疫細(xì)胞的影響，研究員分析了T細(xì)胞和NK細(xì)胞的數(shù)量。共鑒定出16個(gè)亞群其中包括6種CD4+ T細(xì)胞亞型、5種CD8+ T細(xì)胞亞型、2種NK細(xì)胞亞型、γδ T (γδ T)細(xì)胞、1型先天淋巴樣細(xì)胞(ILC1)和3型先天淋巴樣細(xì)胞(ILC3)樣細(xì)胞。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，G-BM中T亞群和NK亞群的百分比下降，這可能是由于骨髓細(xì)胞增加導(dǎo)致的。此外，T細(xì)胞和NK細(xì)胞表現(xiàn)出較高的遷移相關(guān)基因表達(dá)，可能導(dǎo)致了T/NK譜系百分比的降低。

G-BM中T/NK譜系的轉(zhuǎn)錄組變化和免疫調(diào)節(jié)作用的潛在直接機(jī)制

接下來(lái)，作者闡述了G-CSF對(duì)G-BM中T細(xì)胞和NK細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析的影響?？傮w差異表達(dá)基因(DEG)分析顯示，與免疫調(diào)節(jié)相關(guān)的基因表達(dá)上調(diào)。此外，基因評(píng)分分析顯示CD4+ T細(xì)胞的免疫抑制評(píng)分顯著升高，T/NK細(xì)胞的凋亡評(píng)分升高，進(jìn)一步提示G-CSF誘導(dǎo)的免疫抑制特征。在G-CSF作用下，G-BM中的T和NK細(xì)胞一致表現(xiàn)出較高的免疫抑制相關(guān)基因表達(dá)。

研究結(jié)論

該研究分析了G-CSF動(dòng)員前后人骨髓單細(xì)胞精度的轉(zhuǎn)錄組圖譜，揭示了G-CSF刺激導(dǎo)致骨髓內(nèi)造血分化淋髓偏倚的細(xì)胞層級(jí)，并深入解析了G-CSF通過(guò)直接和間接途徑誘導(dǎo)T/NK細(xì)胞免疫低反應(yīng)性的相關(guān)分子特征及潛在機(jī)制?，為臨床上治療血液惡性腫瘤的HSCT策略優(yōu)化及預(yù)防GVHD提供了重要線索。