在RNA-Seq等測序設(shè)計中，生物學(xué)重復(fù)和技術(shù)重復(fù)，是非常需要注意的問題。

那么問題就來了，生物學(xué)重復(fù)和技術(shù)重復(fù)，到底是什么？它們是如何影響我們的實驗設(shè)計的。

生物學(xué)重復(fù)（biological replicate）：可以理解為我們對一個群體進(jìn)行研究，但是我們不會對整個群體進(jìn)行檢測（考慮到成本和工作量的問題，我們肯定也不會采取這種地毯式的方法），只是抽取群體中的一部分進(jìn)行檢測，用樣本來代表總體。

這邊樣本個數(shù)，實際上就是生物學(xué)重復(fù)數(shù)。

技術(shù)重復(fù)（technical replicate）：對一個樣本的數(shù)值進(jìn)行多次測定。

下表給出常見實驗對應(yīng)重復(fù)類型：

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實例

Replication這篇文章以測定小鼠肝臟細(xì)胞中的某一個gene的表達(dá)量為例，展示了什么是生物學(xué)重復(fù)和技術(shù)重復(fù)以及如何權(quán)衡這兩者之間的關(guān)系。

分別給出3種類型的重復(fù)，分別為：
（1）animal水平的重復(fù)
（2）cell水平的重復(fù)
（3）技術(shù)重復(fù)

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由上圖可以得到，3種不同種類的重復(fù)，所計算出來的表達(dá)量方差是不一樣的，但gene表達(dá)量的總方差，可以有下列公式計算得到：

接下來，將總體的重復(fù)次數(shù)限定，即在滿足的前提條件下，對Var(X)進(jìn)行計算。

代表動物樣本數(shù)，代表細(xì)胞樣品數(shù)，代表技術(shù)重復(fù)次數(shù)，是基因表達(dá)量誤差

（的變式，含義是the precision in the expression mean，計算公式為

1、當(dāng)和均為1，為48的情況下，計算出來的Var(X)如下圖標(biāo)記：

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這種情況下，只反映了由于cell樣品重復(fù)和技術(shù)重復(fù)所引起的基因表達(dá)量誤差。當(dāng)n_{A}=1（動物樣品數(shù)為1），即無法計算由于animal樣品數(shù)變化，所帶來的基因表達(dá)量誤差。

因此在上述情況下，就被低估了。

2、當(dāng)和均為1，為48的情況下

計算得到的基因表達(dá)量誤差完全是由于技術(shù)重復(fù)所引起的。因此，如果我們將這種情況下的誤差，認(rèn)定為由生物重復(fù)所引起的，就造成了假陽性。

作者在文章中，還指出了非常重要的一點：雖然增加技術(shù)重復(fù)，可以讓我們對有一個更準(zhǔn)確的估計，但是沒必要。因為提升動物樣品數(shù)，可以使σ_{M}^2可忽略不計（以）。

同時，需要注意的是，將是樣品放入同一批次進(jìn)行測序，減少批次效應(yīng)對數(shù)據(jù)的影響。

同樣地，每一種重復(fù)對于真實基因表達(dá)量的方差貢獻(xiàn)也不是相同的。

因為cell重復(fù)和測定技術(shù)重復(fù)，并是一個獨(dú)立變量。技術(shù)重復(fù)本質(zhì)上是對同一份樣品進(jìn)行測定，數(shù)據(jù)在這種情況下的變異，完全是由于人為或機(jī)器造成的，而cell重復(fù)在本質(zhì)上可以認(rèn)為與animal樣品之間存在相關(guān)性，因此也不是獨(dú)立的。

3、從的角度，來選擇replicate

【標(biāo)注】越小，代表對估計越準(zhǔn)確

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可以看到的是，當(dāng)增大animal重復(fù)數(shù)時，趨于一個穩(wěn)定值，該樣本對總體的估計達(dá)到了一個較為準(zhǔn)確的水平，同時的值也接近于0。

4、從統(tǒng)計檢驗的角度，來選擇replicate

使用two-sample t檢驗，來判斷cell樣品的gene表達(dá)量方差、動物樣品表達(dá)量均值之間是否存在顯著差異。

下圖很明顯的一個結(jié)果就是，隨著的增加，統(tǒng)計檢驗的效能得到提升，假陽性也在降低（同時也得權(quán)衡和）

總結(jié)

對于一組數(shù)據(jù)來說，研究對象的生物重復(fù)比技術(shù)重復(fù)更能夠反映總體，因此在進(jìn)行實驗設(shè)計時，最好將實驗/測序資源傾向這邊，而不是技術(shù)重復(fù)（除非對技術(shù)重復(fù)所誘發(fā)的影響感興趣）

參考資料

[1] 劉小樂老師-哈佛計算生物學(xué)與生物信息學(xué)
[2] Blainey P, Krzywinski M, Altman N. Points of significance: replication[J]. Nature methods, 2014, 11(9): 879.