用到的程序，samtools和bedtools，都用conda安裝。
目標(biāo)是將第一次比對(duì)的bam中unmapped reads提取出來，并轉(zhuǎn)換成fastq進(jìn)行下次比對(duì)。
第一步：提取unmapped reads（格式bam）
用到samtools view
選項(xiàng)：-b #表示生成bam格式??
? ? ? ? ? ?-f? #“The?-f?options flags to keep the reads 'Only output alignments with all bits set in INT present in the FLAG field'”? 保留你選擇的reads?
? ? ? ? ? ?-F #"The?-F?option flags to remove the reads 'Only output alignments with all bits set in INT present in the FLAG field'"? 去除你選擇的reads
示例?
samtools view -b -F 4 -f 8 file.bam > onlyThisEndMapped.bam?
samtools view -b -F 8 -f 4 file.bam > onlyThatEndMapped.bam
samtools view -b -F12 file.bam > bothEndsMapped.bam?
4,8,12這些參數(shù)代表你選擇的reads，具體參見?http://broadinstitute.github.io/picard/explain-flags.html
我是需要提取 unmapped reads，使用 -f 4可以保留所有的unmapped reads
samtools view -b -f 4 file.bam > file_unmapped.bam
但這里面包含的reads包括所有paired和 unpaired，如果只想要paired unmapped reads，可以使用 -f 13
提取出 unmapped.bam后，要把他轉(zhuǎn)化為fastq，可使用bedtools的 “bamToFastq”實(shí)現(xiàn)
注意：bam要先排序！? 不然會(huì)一直報(bào)錯(cuò)，錯(cuò)誤的原因就是在read1附近找不到對(duì)應(yīng)的read2.。我使用samtools以名稱排序。
指令 ： samtools sort -n input.bam output.bam
然后就是bamToFastq了 ：bamToFastq -i < input.bam > -fq < file1.fq > -fq2 < file2.fq >
