自然選擇是達爾文進化論的核心思想。在自然選擇的推動下，生物群體可能逐漸適應環(huán)境，提高自身適應性，從而實現(xiàn)進化；也可能被環(huán)境淘汰，進而導致滅絕。在自然選擇和進化能力的關系上有兩派學說：一派認為強選擇壓會增強生物的進化能力，因為強選擇壓保留下來的性狀適合度很高，在適應環(huán)境的前提下，進化能力也會越來越強。也就是一個正向循環(huán)，適應性強，被保留，被保留的繼續(xù)突變成適應性更強的。另一派認為強選擇壓會有損進化能力。因為選擇壓會清除一些有害突變，而這些有害突變控制新性狀。也就是說沒選擇的時候所有突變都被保留，這時候的進化能力是最強的，因為進化的方向最多。自然選擇學說是否會受到挑戰(zhàn)，自然選擇致使群體進化的能力究竟緣何而來？目前尚不清楚。為了解釋這一問題，Andreas Wagner交出了自己的答卷。
文章信息
- 題目：Selection enhances protein evolvability by increasing mutational robustness and foldability
- 期刊和時間：SCIENCE，2020.12.4
- 作者和單位：通訊作者為瑞士蘇黎世大學Andreas Wagner教授，其實驗室主要關注基因組和進化生物學。本文包括通訊只有三位作者，可想而知并不是以龐大的工作量取勝，而是其他的innovations。
研究背景
- 強選擇壓可能通過保留利于進化的突變，從而加速祖征到衍征的進化；但強選擇壓也可能通過消除弱有害突變減緩群體進化能力（新特性累積少了）。
- 因此作者希望設計實驗來證明究竟是強選擇壓還是弱選擇壓會導致蛋白進化能力的改變。
研究對象
首先要明確的是實驗目的：探究選擇壓與進化能力的關系。那么究竟使用什么材料更好呢？作者想到了黃色熒光蛋白和綠色熒光蛋白，二者結構差距很小，僅需幾個關鍵位點結構變異就可以轉(zhuǎn)化，從而構成“進化”關系。因此作者轉(zhuǎn)化了黃色熒光蛋白到大腸桿菌，并對其施加強(S)/弱(W)/無(N)三種YFP選擇壓，觀察后代的黃色熒光強度（階段一，phase1）從而構建收到選擇壓的三個群體。當然，構建選擇壓群體不是目的，目的在于之后的綠色熒光蛋白進化速度的驗證。在階段一的基礎上，對同一批大腸桿菌進行綠色熒光蛋白的定向選擇（階段二，phase2），作者希望能夠看到YFP向GFP進化的過程，因此篩選對象換成了GFP。試驗全程分選大腸桿菌用的是FACS技術，可以根據(jù)熒光表型篩選出單個大腸桿菌細胞。
研究結果
1.強選擇壓提高蛋白質(zhì)進化能力
作者首先觀察了階段一和階段二培養(yǎng)下的大腸桿菌的熒光強度變化。
注解：橫軸是代數(shù)，縱軸是熒光強度相較于祖先YFP的倍數(shù)。經(jīng)過階段一的選擇，在不同選擇壓下大腸桿菌熒光強度發(fā)生了變化，強選擇壓下有利突變快速固定。弱選擇壓下，大腸桿菌黃色熒光輕微下降，總體圍繞1呈現(xiàn)出有害突變-選擇的平衡。無選擇的大腸桿菌熒光強度下降到祖先的5%，表明有害突變在積累（B圖）。而后作者對階段一每一代YFP進行了三代測序（SMRT），發(fā)現(xiàn)在遺傳多樣性上S<W<N（supplemental FigS1和S2：本文附加材料地址如下，https://www.science.org/doi/suppl/10.1126/science.abb5962/suppl_file/abb5962_zheng_sm.pdf）。因此作者一度以為弱選擇會通過累計足夠多的變異從而使黃色熒光更快進化成綠色熒光。但是，二階段選擇綠色熒光進化速度卻是S>W，綠色熒光強度更強（C圖）。強選擇壓反而更能促進衍征的進化。
2.對祖先性狀施加強選擇壓利于新功能突變的固定
為什么強選擇導致了更強的進化能力呢？作者用三代測序測量了階段二中每一代大腸桿菌的YFP的遺傳多態(tài)性，熱圖顏色代表出現(xiàn)頻率。發(fā)現(xiàn)G66S和Y204C兩個突變在每一代都會出現(xiàn)（Fig2最左圖）。Fig2中的完整熱圖在下方，能看到強選擇S，弱選擇W和無選擇N下G66S和Y204C兩個突變都會出現(xiàn)。因此作者將G66S和Y204C視為universal mutations，和剩下二十個突變都可能導致了黃變綠，這兩個就是其余突變的基礎。經(jīng)過測序發(fā)現(xiàn)突變頻率也在積累，也就是右圖的C。所以作者單獨構建了兩個單突，也構建了YFP雙突，也就是U。G66s明顯將黃色熒光蛋白廣譜轉(zhuǎn)移到了綠色。之前20個其余的突變中有9個配合U也能改變激發(fā)光。回到C，作者也觀察到兩單加一雙（G66s，Y204C，U）在階段二中快速積累，積累速度在強選擇下明顯更快。但是兩單加一雙的積累也引發(fā)了一個悖論：明明階段一有選擇時整體突變會更少，但是在階段二仍然能快速積累突變。作者認為在強選擇壓下，群體發(fā)生的突變很有可能是更加穩(wěn)定的，穩(wěn)定的蛋白會導致進一步穩(wěn)定的突變。作者顯然是支持自然選擇和進化能力的關系的假說一。
3.強選擇壓比弱選擇壓能帶來更強的突變穩(wěn)定性和更高的可折疊性
為了驗證這一假說，就要想辦法驗證三個選擇壓下的群體蛋白質(zhì)的折疊和穩(wěn)定性情況。因此作者在階段一之后誘發(fā)突變了三個群體并且測定了突變后的黃色熒光強度。希望從蛋白抵抗突變的角度證明其穩(wěn)定性。
注解：A圖是誘變后的黃色熒光相比于未誘變時的比值。高選擇壓下群體S的熒光值折損最小，說明此時群體更不容易被誘發(fā)突變，穩(wěn)定性更高。且誘導后發(fā)黃色熒光和綠色熒光的個體比例，也呈現(xiàn)出強選擇壓下更穩(wěn)定的情況，即B圖。說明的確強選擇壓能帶來更強的穩(wěn)定性來抵抗突變，不僅是質(zhì)量也是數(shù)量上的。也就是說決定變色的突變越穩(wěn)定，越不容易受環(huán)境影響，在選擇時被保留的幾率越大。這也是為什么強選擇壓群體中兩個突變加速積累的原因：因為群體更穩(wěn)定了。而蛋白質(zhì)穩(wěn)定性很大程度上受到了可折疊性的影響。而折疊的效率和穩(wěn)定性可以通過可溶蛋白濃度和復性速率來衡量。因此作者測量可溶蛋白的數(shù)量和不可溶蛋白的比例（C和D圖），結果的確在強選擇壓群體S下可溶蛋白數(shù)量最多，不可溶蛋白比例相反。E圖復性率上同樣是強選擇壓群體更快。因此，選擇壓通過增加蛋白可折疊型和復性率提高穩(wěn)定性。
為了進一步證實復性率和蛋白穩(wěn)定性的關系，作者在眾多促進折疊性的YFP中找到了四個已經(jīng)報道的位點：F47L, F65L, V164A, and I172V。同時也發(fā)現(xiàn)了一個突變：K102E在階段一之后相對于弱選擇和不選擇頻率也達到了很高。將五個突變的突變體蛋白去折疊之后檢測其復性的速度（Fig4A），結果發(fā)現(xiàn)五個突變體的復性率都快于祖先YFP。五個蛋白突變體都有助于提高YFP的復性能力。此外，對于隨機突變的穩(wěn)定性也能反映蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。作者對這五個突變體利用PCR引入了隨機突變，觀察熒光在引入隨機突變前后的比例。剛剛提到的五個促進折疊性的蛋白中，四個蛋白的熒光值都超過了祖先的恢復程度。只有K102E與祖先的熒光顯著程度小（Fig4B）。至此，作者找到了影響折疊能力的突變位點，并且證明了這些位點與蛋白穩(wěn)定性的關系。
4.蛋白可折疊性的提高加速其自身進化
將進化能力的增加只歸結為蛋白穩(wěn)定性的增強顯然是不夠深入的。需要進一步研究穩(wěn)定性的增強如何影響進化能力。完成一個從what到how的過程。作者將分別從有益突變和有害突變兩個角度衡量進化。
注解：在每一代大腸桿菌選擇過程中引入隨機突變，強選擇壓的群體中，高于祖先的綠色熒光細胞的比例比其他兩個選擇壓更高（A圖）。也就是說在蛋白折疊性增強，穩(wěn)定性增強的同時，還提高了熒光蛋白的強度。也就是說強選擇壓導致蛋白穩(wěn)定性增強的同時，也會選擇出熒光強度的控制位點，這個過程很可能發(fā)生selective sweep增加綠色熒光蛋白的位點多態(tài)性。既然能引發(fā)SS，那么這些位點就可能既關聯(lián)于穩(wěn)定性，又關聯(lián)于熒光強度。那該如何量化一個位點關聯(lián)兩種性質(zhì)的比例呢？作者在這里定義了穩(wěn)定性的比例。1減去穩(wěn)定性所占的比例，剩下的就是控制熒光的比例。據(jù)此算出了五個影響折疊能力位點對兩個性狀的貢獻比例。我們能看到穩(wěn)定性的貢獻還是占多數(shù)的（B圖）。也就是說綠色熒光性狀的快速積累更大程度得益于穩(wěn)定性增強，而非黃色熒光的加深。
作者又提出假設，既然增強穩(wěn)定性的突變會促進有益突變保留，但也會保留下有害突變。 有益突變?nèi)绻谏w了有害突變，則后者也會被保留。但是綠色熒光的快速富集，且黃色熒光沒有富集那就說明一點，有害突變沒有被保留，而是被清除。為了證明強選擇壓會消除有害突變，作者對YFP引入了無義突變，觀察階段一對YFP的選擇會如何影響無義突變的頻率。結果發(fā)現(xiàn)無義突變在兩個有選擇壓的情況下都減少了（Fig6A）。這里的圖A，橫軸是代數(shù)，縱軸是不穩(wěn)定突變的頻率。說明有害突變在被消除。同時作者用FoldX算法預測了蛋白質(zhì)不穩(wěn)定突變的比例（Fig6C），發(fā)現(xiàn)兩個選擇壓的情況下，不穩(wěn)定突變頻率下降。至此，作者證明了突變穩(wěn)定性的增強消除了有害突變。
最后我們總結一下整篇文章：
為了探究選擇如何影響進化能力。作者發(fā)現(xiàn)強選擇壓會導致進化能力提升。
- 進化能力的提升來自于突變穩(wěn)定性和可折疊性的增強。
- 突變穩(wěn)定性的增強促進了適應性突變的積累，消除了有害突變。
- 得益于這些能夠增強蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的位點，群體能夠保留核酸多態(tài)性，從而順利進化度過適應性低谷。
- 最終結論一句話：想要完成進化，與其吞吞吐吐，不如大刀闊斧。
科學的盡頭總有點哲學內(nèi)味兒~
參考信息：
1.Zheng J, Guo N, Wagner A. Selection enhances protein evolvability by increasing mutational robustness and foldability. Science. 2020;370(6521):eabb5962. doi:10.1126/science.abb5962
