問題
如何將單細胞數(shù)據(jù)導入 R？
不同類型的數(shù)據(jù)/信息（例如細胞信息、基因信息等）是如何存儲和操作的？
如何獲得細胞和基因的基本匯總指標并相應(yīng)地過濾數(shù)據(jù)？
如何直觀地探索這些指標？
學習目標：
了解單細胞數(shù)據(jù)如何存儲在Bioconductor SingleCellExperiment對象中。
從處理后的scRNA-seq count數(shù)據(jù)創(chuàng)建一個SingleCellExperiment對象。
訪問SingleCellExperiment對象的不同部分，例如rowData、colData和analysis。
從矩陣中獲取幾個匯總指標，以匯總跨細胞或基因的信息。
通過構(gòu)建邏輯向量并使用[運算符對對象進行子集化，將基本過濾器應(yīng)用于數(shù)據(jù)。
直接從存儲在SingleCellExperiment對象中的數(shù)據(jù)生成基本的數(shù)據(jù)可視化。

在本章中，我們將開始對分析中使用到的核心包進行實際介紹。
我們將使用芝加哥大學Yoav Gilad實驗室中來自三個不同個體（Tung et al. 2017）的誘導多能干細胞數(shù)據(jù)集。實驗在Fluidigm C1平臺上進行，使用唯一分子標識符（UMI）進行定量。數(shù)據(jù)文件位于工作目錄中的data/tung文件夾中。原始文件位于GEO中GSE77288（GSE77288_molecules-raw-single-per-sample.txt.gz）。

注意：
這些數(shù)據(jù)缺少以下幾點：
稀疏矩陣。由于使用的是tung數(shù)據(jù)集，因此我們只得到一個常規(guī)矩陣。如果我們決定使用10x數(shù)據(jù)集，那么引入它可能會更容易。
rowData - 沒有包含任何基因注釋，盡管也可以輕松地包含它，例如有關(guān)哪些基因是核基因或線粒體基因的信息。

4.1 scRNA-seq分析軟件包
有幾種軟件包（或軟件“生態(tài)”）可用于單細胞分析。在本課程中，我們將重點介紹Bioconductor項目中的一組軟件包。
Bioconductor是專為生物分析開發(fā)的R軟件包庫。它擁有一系列出色的scRNA-seq分析軟件包，這些軟件包在《使用Bioconductor進行單細胞分析》一書中進行了總結(jié)。Bioconductor的優(yōu)點在于它對包提交有嚴格的要求，包括在每個平臺上的安裝以及帶有教程的完整文檔，解釋如何使用該包。Bioconductor還鼓勵使用標準數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)/類和編碼風格/命名約定，以便理論上可以將包和分析組合成大型流程或工作流。具體來說，對于scRNA-seq，使用的標準數(shù)據(jù)對象稱為SingleCellExperiment，我們將在本節(jié)中詳細了解它。
Seurat是另一個流行的R軟件包，它使用自己的數(shù)據(jù)對象Seurat。Seurat軟件包包含大量函數(shù)和出色的文檔。由于其受歡迎程度，如今其他幾個軟件包也與Seurat對象兼容。雖然這不是本課程的重點，但我們有一個部分說明了使用此包的分析工作流程：使用Seurat分析scRNA-seq。
Scanpy是一個流行的scRNA-seq分析的python包，它將數(shù)據(jù)存儲在名為AnnData的對象中。與Seurat和Bioconductor類似，開發(fā)人員可以為與AnnData包兼容的主包編寫擴展，從而允許社區(qū)擴展其功能。
雖然我們主要關(guān)注Bioconductor包，但我們將在本課程中學習的概念適用于其他替代方案，主要變化的是所使用的確切語法。
4.2 SingleCellExperiment對象
表達數(shù)據(jù)通常存儲在定量后的特征x細胞表達矩陣中。在scRNA-seq分析中，我們通常從count矩陣開始分析，代表每個細胞中特征的read/UMI的數(shù)量，特征可以是基因、異構(gòu)體或外顯子等。通常，分析是在基因?qū)用孢M行的，這也是我們在本課程中將重點關(guān)注的。
除了定量矩陣之外，還可能有每個基因的信息（例如它們的基因組位置、它們屬于哪種基因、它們的長度等）以及細胞的信息（例如，其來源組織、患者捐贈者、處理批次、疾病狀況、治療暴露等）。
我們還可以根據(jù)原始count數(shù)據(jù)生成其他矩陣，例如標準化count矩陣。最后，由于單細胞實驗數(shù)據(jù)維度非常高，我們經(jīng)常采用降維技術(shù)來捕捉較低維度數(shù)據(jù)中的主要變化。
SingleCellExperiment（簡稱SCE）是一個以同步方式存儲所有這些信息的對象。可以通過特殊函數(shù)訪問該對象的不同部分：

• 可以通過assay或assays函數(shù)來訪問一個或多個表達矩陣。
• 可以使用rowData函數(shù)獲取有關(guān)基因的信息。
• 可以通過colData函數(shù)訪問有關(guān)細胞的信息。

其中一些數(shù)據(jù)存儲在具有相似名稱的插槽中，可以通過@運算符訪問，但使用訪問器函數(shù)被認為是一種更好的編程風格。

SingleCellExperiment對象。特征（例如基因、異構(gòu)體或外顯子）存儲為行，其元數(shù)據(jù)位于rowData中。細胞以列的形式存儲，其元數(shù)據(jù)存儲在colData中。表達矩陣存儲在assay中。細胞的降維投影存儲在reducedDim中。

4.2.1 創(chuàng)建SCE對象
測試數(shù)據(jù)下載地址：https://singlecellcourse.cog.sanger.ac.uk/index.html?shared=data/
首先，根據(jù)數(shù)據(jù)創(chuàng)建一個SingleCellExperiment對象。data/tung中有兩個文件：

• counts.txt—— 一個制表符分隔的文本文件，包含每個基因/細胞的基因計數(shù)。
• annotation.txt—— 帶有細胞注釋的制表符分隔的文本文件。

使用read.table()函數(shù)將它們讀入R：

> tung_counts <- read.table("data/tung/molecules.txt", sep = "\t")
> tung_annotation <- read.table("data/tung/annotation.txt", sep = "\t", header = TRUE)

現(xiàn)在可以使用同名函數(shù)創(chuàng)建一個SingleCellExperiment對象：

> library(SingleCellExperiment)
> tung <- SingleCellExperiment(
  assays = list(counts = as.matrix(tung_counts)),
  colData = tung_annotation
)
> rm(tung_counts, tung_annotation)

如果我們打印該對象的內(nèi)容，我們將得到一些有用的信息：<

> tung
class: SingleCellExperiment 
dim: 19027 864 
metadata(0):
assays(1): counts
rownames(19027): ENSG00000237683 ENSG00000187634 ... ERCC-00170
  ERCC-00171
rowData names(0):
colnames(864): NA19098.r1.A01 NA19098.r1.A02 ... NA19239.r3.H11
  NA19239.r3.H12
colData names(5): individual replicate well batch sample_id
reducedDimNames(0):
altExpNames(0):

• 共有19027個基因（行）和864個細胞（列）。
• 有一個名為“counts”的assay。
• 提供了一些基因名稱（“rownames”）和細胞名稱（“colnames”）的預覽。
• 沒有基因元數(shù)據(jù)（“rowData”為空）。
• 可以看到細胞的一些元數(shù)據(jù)（“colData”）。

要訪問SCE對象的不同部分，可以使用以下訪問器函數(shù)：

命名Assay
我們可以隨意給assay取名。不過，需要遵循一些慣例：

• counts：原始計數(shù)數(shù)據(jù)，例如特定基因的read數(shù)或轉(zhuǎn)錄本數(shù)。
• normcounts：與原始計數(shù)具有相同尺度的標準化值。例如，counts除以以1為中心的細胞特定尺度因子。
• logcounts：對數(shù)轉(zhuǎn)換計數(shù)或類似計數(shù)的值。在大多數(shù)情況下，定義為對數(shù)轉(zhuǎn)換的normcounts，例如使用以2為底的對數(shù)和偽計數(shù)1。
• cpm：每百萬計數(shù)。這是每個細胞中每個基因的read數(shù)，除以每個細胞的文庫大?。ㄒ园偃f為單位）。
• tpm：每百萬轉(zhuǎn)錄本數(shù)。這是每個細胞中每個基因的轉(zhuǎn)錄本數(shù)除以該細胞中的轉(zhuǎn)錄本總數(shù)（以百萬為單位）。

每個assay都有一個函數(shù)訪問，可以使用counts()函數(shù)訪問“counts” assay。以下兩個操作是等效的：

counts(tung)
assay(tung, "counts")

如上所創(chuàng)建的SingleCellExperiment對象適用于任何場景，只要我們有一個可以讀取到文件中的計數(shù)矩陣。當然，要讀取常用工具cellranger（用于處理10x Chromium數(shù)據(jù)）的輸出，DropletUtils包中有一個專用函數(shù)，它簡化了導入數(shù)據(jù)的過程。以下是示例用法：<

> library(DropletUtils)
> sce <- read10xCounts("data/pbmc_1k_raw")
> sce <- read10xCounts("data/pbmc_1k_filtered")

4.2.2 修改SCE對象
要修改SCE對象的某些部分，我們可以使用<-賦值運算符，以及我們想要修改的對象的部分。例如，要創(chuàng)建一個新的assay：assay(sce, "name_of_new_assay") <- new_matrix。下表總結(jié)了其他用例。
舉個例子，對計數(shù)數(shù)據(jù)進行一個簡單的轉(zhuǎn)換，即取以2為底的對數(shù)并加上偽計數(shù)1（否則 log(0) = -Inf）：

> assay(tung, "logcounts") <- log2(counts(tung) + 1)

因為我們將assay命名為“l(fā)ogcounts”，這是常規(guī)的名稱之一，所以我們可以使用專用函數(shù)來訪問它：

> logcounts(tung)[1:10, 1:4]
                NA19098.r1.A01 NA19098.r1.A02 NA19098.r1.A03 NA19098.r1.A04
ENSG00000237683       0.000000       0.000000       0.000000              1
ENSG00000187634       0.000000       0.000000       0.000000              0
ENSG00000188976       2.000000       2.807355       1.000000              2
ENSG00000187961       0.000000       0.000000       0.000000              0
ENSG00000187583       0.000000       0.000000       0.000000              0
ENSG00000187642       0.000000       0.000000       0.000000              0
ENSG00000188290       0.000000       0.000000       0.000000              0
ENSG00000187608       1.000000       3.000000       0.000000              2
ENSG00000188157       1.584963       2.000000       1.584963              2
ENSG00000237330       0.000000       0.000000       0.000000              0

以下是修改SCE對象中數(shù)據(jù)的其他方法的總結(jié)：

往期內(nèi)容：
重生之我在劍橋大學學習單細胞RNA-seq分析——3. 單細胞分析中的R/Bioconductor簡介（1）
重生之我在劍橋大學學習單細胞RNA-seq分析——3. 單細胞分析中的R/Bioconductor簡介（2）
重生之我在劍橋大學學習單細胞RNA-seq分析——3. 單細胞分析中的R/Bioconductor簡介（3）
重生之我在劍橋大學學習單細胞RNA-seq分析——3. 單細胞分析中的R/Bioconductor簡介（4）