忘記從哪里轉(zhuǎn)載來(lái)的文章了，并做了部分改動(dòng)。首先對(duì)作者表示深深的歉意，如果將來(lái)作者本人認(rèn)領(lǐng)了，請(qǐng)及時(shí)留言或聯(lián)系，我必將標(biāo)注來(lái)源。
做好Western需要注意各種細(xì)節(jié)。工欲善其事，必先利其器，首先還是從蛋白提取開(kāi)始談起。
壹：蛋白提取
一、細(xì)胞蛋白的提取
1.收樣前3min先配制細(xì)胞裂解液（現(xiàn)配現(xiàn)用），RIPA:蛋白酶抑制劑:磷酸酶抑制劑=99:1:1。6孔板收集蛋白每孔需200ul，計(jì)算用量。以收集六孔蛋白為例，按比例加入RIPA 1200ul，蛋白酶抑制劑12ul，磷酸酶抑制劑12ul，混勻后置于冰上。（我使用的試劑RIPA裂解液（中），蛋白酶抑制劑混合物（100×），蛋白磷酸酶抑制劑混合物（100×）均購(gòu)自***公司）
2.棄掉舊的培養(yǎng)基，PBS洗三遍。
3.每孔加入200ul剛配好的裂解液，立即置于冰上，在搖床上裂解30min。
- 30min后在冰上將6孔板中的細(xì)胞收集至EP管中（盡可能多地刮掉細(xì)胞）。
- 14000g，15min（4℃）離心，取上清于EP管中即為提取的蛋白（最好用進(jìn)口Axygen EP管，后文解釋原因）。
注：2~4步也可先用胰酶收集細(xì)胞，離心，PBS洗三次，再向EP管中加入裂解液，置于冰上搖床裂解30min。我也嘗試過(guò)這種方法，相比而言，上一種方法簡(jiǎn)便并節(jié)約時(shí)間，但可能會(huì)損失一些細(xì)胞，可根據(jù)實(shí)際情況選擇。
二、組織蛋白的提取
（全程在冰上操作）
1.將動(dòng)物組織（腦、肺等）取出后分裝成三份或更多（一份WB，一份qPCR，一份備用），取出后立即存于-80℃。（注：取完一塊組織后立即凍存于-80℃，反復(fù)凍存樣品對(duì)待測(cè)蛋白有影響，最好用新鮮樣品實(shí)驗(yàn)）
2.配制細(xì)胞裂解液（現(xiàn)配現(xiàn)用），組織:RIPA=1mg:10ul，可根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整。RIPA:蛋白酶抑制劑:磷酸酶抑制劑=99:1:1。配好后置于冰上。
3.將其中一份組織剪下約90mg于有鋼珠的震蕩勻漿器中勻漿。此勻漿器的蓋子或芯通常置于-20℃，使用時(shí)取出，操作應(yīng)快捷，勻漿1min基本可保持溫度。
4.將勻漿加入90ul現(xiàn)配的裂解液中，冰上搖床裂解30min。
- 14000g，15min（4℃）離心，取上清于Axygen EP管中即為提取的蛋白。
貳：蛋白濃度測(cè)定
我采用的是***公司的BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定提取蛋白濃度，和說(shuō)明書(shū)protocol差別不大，稍有不同，如下：
1.稀釋BSA標(biāo)準(zhǔn)品以制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)：取7支EP管，每管加30ul生理鹽水，第一管加30ulBSA，混勻后再取30ul至第二管，依次倍比稀釋?zhuān)詈笠还懿患訛榭瞻祝幢镜字担?。則8個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度分別為2ug/ul、1ug/ul、0.5ug/ul、0.25ug/ul、0.125ug/ul、0.0625ug/ul、0.03125ug/ul、0。
- 5倍稀釋樣品蛋白：取六支EP管（6個(gè)樣品），各管加40ul NS，再分別取10ul樣品在各管中稀釋。
3.將8個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和稀釋待測(cè)樣品各加25ul于96孔板中。
4.配制BCA工作液：每個(gè)樣品做2個(gè)重復(fù)，再加上8個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品，一共20個(gè)孔，按22個(gè)孔算，以防加樣損失。則需A液：200ul×22=4400ul，B液：4400ul/50=88ul，計(jì)算好所需體積后在一干凈試管中將A、B工作液混勻。
6.混勻后立即向各孔中加入200ul配制的BCA工作液，37℃孵育30min。
7.酶標(biāo)儀562nm下測(cè)定各樣品和BSA標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算出待測(cè)樣品的濃度。
8.根據(jù)各樣品濃度計(jì)算1×loading buffer體積，將各樣品濃度調(diào)為一致；并計(jì)算5×loading buffer的體積，加入各管中?；靹蚝蠓兴?5min，冰上分裝，存于-20℃。
Tips
1.前面提到收集蛋白于進(jìn)口Axygen EP管中，是為了防止煮沸蛋白時(shí)EP管蓋子彈開(kāi)，液體濺出而改變蛋白濃度。
2.關(guān)于分裝體積，我提取的細(xì)胞蛋白調(diào)整濃度后約為1.5ug/ul，每次電泳上樣20ul，所以分裝體積每管50ul，一次或兩次電泳即可用完，避免反復(fù)凍融。
叁：Western Blot
一、WB所需試劑
可提前配制：
- 10×電泳緩沖液：
配制250ml 10×電泳液作為母液，依次稱(chēng)取Tris 7.5g，甘氨酸36g，SDS 2.5g，加雙蒸水至250ml，常溫保存。使用時(shí)用蒸餾水稀釋至1×。 - 1×電轉(zhuǎn)液：
配制500ml 1×電泳液，依次稱(chēng)取Tris 2.9g，甘氨酸1.45g，SDS 0.185g，加雙蒸水400ml，待都溶解后再加入100ml甲醇，常溫保存。
配制的電泳液和電轉(zhuǎn)液可供多次Western使用。
注意：1.最后加入甲醇，若先加甲醇，Tris、甘氨酸和SDS不易溶解。
2.溶解較慢時(shí)可用磁力攪拌器加快溶解。
現(xiàn)配現(xiàn)用：
分離膠、濃縮膠、5% BSA溶液(w/v)、5%牛奶(w/v)、1×TBST洗液、一抗和二抗，在WB步驟中詳細(xì)介紹。
二、WB protocol
（一）清洗玻板和小燒杯：
戴好口罩和手套，選用1.0mm玻板，用試管刷和洗潔精仔細(xì)刷洗玻板，清水沖洗干凈。卡槽對(duì)齊卡好后置于軟橡膠墊片上，夾緊，向板中加滿(mǎn)蒸餾水試板子是否漏液。觀(guān)察幾分鐘后若不漏液，將板子中水倒出，倒扣晾干。
（二）配膠：
1.配制8ml 10%分離膠，依次向小燒杯中加入蒸餾水3.04ml，30%丙烯酰胺2.7ml，1.5M?pH8.8 2.0ml，10%SDS 80ul，10%AP 80ul，TEMED 3.2ul。加入TEMED混勻后立即灌膠，用1ml槍頭沿著玻板上沿從左至右輕輕將膠打入，以免膠濃度不均勻，避免氣泡產(chǎn)生。加完后換200ml槍頭從左至右更加小心加入蒸餾水水封，以免沖散剛灌的分離膠。靜置，當(dāng)水和膠之間出現(xiàn)一條水平的折線(xiàn)時(shí)，即已凝固。
2.待分離膠凝固后，將水封的蒸餾水倒出，可將濾紙條放于玻板角吸水加快殘留水流出，倒置。配制4ml 5%分離膠，依次向小燒杯中加入蒸餾水2.7ml，30%丙烯酰胺670ml，0.5M?pH8.8 500ul，10%SDS 40ul，10%AP 40ul，TEMED 4ul。加入TEMED混勻后立即灌膠，同上用1ml槍頭從左至右輕輕加入濃縮膠，加滿(mǎn)后沖洗10孔梳子，水平輕輕插入濃縮膠中靜置待其凝固?？蓪⑹Ｓ嗟臐饪s膠沿著梳子加入玻板中以完全密封。
3.此時(shí)，可將之前分裝好的煮過(guò)的加入loading buffer的蛋白樣品、預(yù)染的蛋白maker 和一小支loading buffer 置于4℃融化。
Little Trick
1.AP和TEMED均為神經(jīng)毒性、致癌物質(zhì)，使用時(shí)需小心。
2.灌膠時(shí)視線(xiàn)與膠面水平，注意操作，避免膠濺入眼睛中。
3.常溫下半小時(shí)膠可凝固，若天氣寒冷或需加快凝固，可將其置于37℃孵箱中，15min左右即可凝固。
4.若第二天早上立即跑膠，這樣就不耽誤午飯時(shí)間，可頭天晚上先把膠配好，凝固后取下玻板，連夾子、梳子一同放入蒸餾水中，4℃過(guò)夜保存。
（三）電泳：
1.將玻板卡緊電泳槽中，先在內(nèi)槽加滿(mǎn)已配好的1×電轉(zhuǎn)液，十幾分鐘后觀(guān)察是否漏液，若漏液重新調(diào)整玻板，再次卡緊，直至不漏液為止。否則，可能膠還沒(méi)跑完，電轉(zhuǎn)液就漏完了。
2.輕輕拔去梳子，第一孔加入5ul預(yù)染的蛋白maker ，2~7孔依次加入20ul待測(cè)蛋白樣品，第8孔加入10ul提前融化的loading buffer。上樣時(shí)輕輕加入，注意不要將樣品加入其他孔，或加樣過(guò)快導(dǎo)致樣品溢出。
3.插好正負(fù)極，注意檢查正負(fù)極不能插反。調(diào)節(jié)電壓至80V（濃縮膠），跑0.5h后；將電壓調(diào)至100V（分離膠），約1.5h后，maker分離明顯，在膠底部出現(xiàn)一條藍(lán)色的buffer條帶，此時(shí)電泳完畢。使用完在實(shí)驗(yàn)儀器使用本上做好登記。
注意：避免藍(lán)色條帶跑出分離膠，這樣有可能目的蛋白也已經(jīng)跑出，所以在分離膠底部出現(xiàn)一條整齊水平的藍(lán)色條帶時(shí)，即停止電泳。
Little Trick
1.電泳時(shí)插好正負(fù)極后，從電泳槽底會(huì)有小氣泡上升，氣泡的數(shù)目和上升速率與電壓大小呈正比。若小氣泡和往常不太一樣，觀(guān)察幾分鐘后還是如此，則需檢查是否加錯(cuò)了電泳液，或者電泳液配制有誤。
2.一般濃縮膠80V 0.5h，分離膠100~120V 1~1.5h，具體跑膠電壓和時(shí)間與目的蛋白大小、實(shí)驗(yàn)儀器和實(shí)驗(yàn)室環(huán)境都有關(guān)，需多次探索最佳條件。若目的蛋白較小，則盡量縮短跑膠時(shí)間，并及時(shí)觀(guān)察maker位置，避免目的蛋白跑出。我分別實(shí)驗(yàn)了濃縮膠80V 0.5h，80V 1h，分離膠120V 1.5h，120V 1h，100V 1.5h，100V 1h，110V 1.5h，110V 1h，結(jié)果顯示在本實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)儀器下，我的目的蛋白及內(nèi)參在濃縮膠80V 0.5h，分離膠100V 1.5h條件下，分離效果最好。在此條件下，我做了幾次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果均一致。因此，總結(jié)出本實(shí)驗(yàn)室此目的蛋白的最佳電泳條件。
3.電泳的好壞直接影響到目的蛋白的顯影情況，尤其時(shí)磷酸化目的蛋白的二聚體，若電泳條件優(yōu)化，結(jié)果可清晰顯出蛋白表達(dá)情況。所以探索最佳電泳條件是決定勝負(fù)關(guān)鍵一步。
4.電泳快結(jié)束時(shí)即可準(zhǔn)備轉(zhuǎn)膜所需的濾紙和PVDF膜，浸泡在電轉(zhuǎn)液中。建議在第一次WB后分別剪好不同大小的硬紙片，標(biāo)好面積和孔數(shù)（即樣品數(shù)），存好以后隨時(shí)使用。
5.WB中夾取PVDF膜最好使用平頭鑷子，并夾住膜左上角，可最大程度減小對(duì)膜上蛋白的損害。
（四）切膠：
電泳結(jié)束后，取出玻璃板，稍微沖洗，洗凈電泳槽，放好。輕輕撬開(kāi)玻璃板，根據(jù)maker位置和目的蛋白分子量大小在玻璃板上切膠，為了防止切歪，可在玻璃板下墊上上述剪好的同切膠大小一致的硬紙片。一般一塊膠需切下目的蛋白和內(nèi)參兩小塊膠，將切下的膠分別浸泡在電轉(zhuǎn)液中。
（五）轉(zhuǎn)膜：
1.根據(jù)每一塊切膠的大小剪6張同樣大小的濾紙和一張PVDF膜，浸泡于電轉(zhuǎn)液中，可以提前準(zhǔn)備好的硬紙片為模板剪。PVDF膜先經(jīng)甲醇活化20s后浸泡于電轉(zhuǎn)液中。
2.在電轉(zhuǎn)儀上制作“三明治”結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)移膜，最下面放三層濾紙，然后依次放PVDF膜，膠，三層濾紙，用玻璃棒輕輕趕走氣泡（注意上下三層濾紙之間不能接觸，否則易造成短路）。蓋上蓋子，根據(jù)膜的總面積調(diào)整電流，電轉(zhuǎn)2h。
3.在電轉(zhuǎn)的同時(shí)，可以配制以下液體，事先根據(jù)膜的數(shù)量計(jì)算好所需體積：
以一塊膜為例，封閉5ml+稀釋一抗4ml+稀釋二抗4ml，需要13ml，則配制15ml。
5% BSA溶液(w/v)：配制15ml 5% BSA溶液(w/v)，稱(chēng)取0.75g BSA晶體，溶于15mlTBST中，漩渦振蕩器混勻，現(xiàn)用現(xiàn)配，4℃保存（若目的蛋白為磷酸化蛋白時(shí)配制）。
5%牛奶(w/v)：配制15ml 5%牛奶(w/v)，稱(chēng)取0.75g脫脂奶粉，溶于15ml TBST中，漩渦振蕩器混勻，現(xiàn)用現(xiàn)配，4℃保存。
1×TBST洗液：使用時(shí)將100×TBST用雙蒸水稀釋至1×，常溫保存。
Little Trick
1.關(guān)于電轉(zhuǎn)膜，有些使用NC膜。我沒(méi)有嘗試過(guò)NC膜，但隔壁實(shí)驗(yàn)室使用NC膜多次WB結(jié)果仍不理想，換用PVDF膜后有所改善。因此建議還是使用PVDF膜，可購(gòu)買(mǎi)Millipore的PVDF膜，一卷有些貴，但是可以夠一個(gè)實(shí)驗(yàn)室用好幾年哪。最好不要在經(jīng)銷(xiāo)商購(gòu)買(mǎi)分裝的的PVDF膜，另一實(shí)驗(yàn)室一同學(xué)想著價(jià)格便宜也就只做幾次，就從試劑公司只買(mǎi)了100cm2的膜，結(jié)果這價(jià)格虛高不說(shuō)，而且膜還是假的，直到做完實(shí)驗(yàn)了才發(fā)現(xiàn)，蛋白樣品也浪費(fèi)了。所以建議還是購(gòu)買(mǎi)Millipore公司原裝的PVDF膜。
2.關(guān)于電轉(zhuǎn)方式，有些采用濕轉(zhuǎn)，有些采用半干轉(zhuǎn)，兩種方式均可。個(gè)人覺(jué)得半干轉(zhuǎn)方便簡(jiǎn)捷些。
（六）封閉：
1.電轉(zhuǎn)結(jié)束后，根據(jù)maker位置和目的蛋白及內(nèi)參大小剪膜?？稍跇?biāo)有maker的一邊左上角剪一個(gè)小角，以清楚哪一條帶是1號(hào)樣品。
2.分別用已配好的5% BSA和5%牛奶封閉目的蛋白和內(nèi)參，室溫?fù)u床上孵育2h。根據(jù)盒子大小，加入封閉液的量需沒(méi)過(guò)膜。
（七）孵育一抗：
1.配制p-STAT1一抗（公司），1:500稀釋?zhuān)尤肷鲜雠渲频?% BSA 4ml，再加入8ul p-STAT1一抗，混勻，現(xiàn)配現(xiàn)用。
配制actin一抗（公司），1:2000稀釋?zhuān)尤肷鲜雠渲频?%牛奶4ml，再加入2ul actin一抗，混勻，現(xiàn)配現(xiàn)用。
2.將PVDF膜從封閉液中取出，可用平頭鑷子小心放入塑料手套的手指中，加入一抗，封口，使膜完全浸泡在一抗中，放入冰箱，4℃過(guò)夜。我一般用封口膜做成小盒，置于大玻璃平皿中，放入PVDF膜，用槍從上到下向膜上加一抗，完全浸沒(méi)，之后和PCR上樣儀一同固定在搖床上，4℃孵育過(guò)夜。
（八）回收一抗：
次日，回收一抗，做好標(biāo)記，-20℃保存，可再使用3~4次。將膜放入1×TBST中，搖床上清洗三次，每次10min。
（九）孵育二抗：
1.配制具有種屬特異性的HRP標(biāo)記的二抗（抗鼠或抗兔），1:2000稀釋?zhuān)尤肷鲜雠渲频?%牛奶4ml，再加入2ul 二抗，混勻，現(xiàn)配現(xiàn)用。
2.TBST洗完膜后，加入二抗，室溫?fù)u床上孵育2h。
（十）顯影：
1.二抗孵育完后，回收，-20℃保存。1×TBST搖床上洗膜三次，每次10min。
2.一條目的蛋白即一張膜需要100ul發(fā)光液A和100ul發(fā)光液B，根據(jù)膜數(shù)計(jì)算用量，提前4℃混合好發(fā)光液A和B。
3.到暗室中加混合好的發(fā)光液，在膠片左上角剪一小角（和PVDF膜一致），曝光膠片，可分別不同時(shí)長(zhǎng)曝光，如15s，30s，1min，5min等，然后在顯影液和定影液中顯影，放入自來(lái)水中。出暗室后，將膠片掛起晾干。
也可用Bio-rad凝膠成像系統(tǒng)照相，選擇不同的曝光時(shí)間成像。
Little Trick1.需通過(guò)不同曝光時(shí)間探索某蛋白最佳曝光時(shí)間，多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)即可采用此曝光時(shí)長(zhǎng)。我最開(kāi)始也是在暗室中顯影，后來(lái)用Bio-rad凝膠成像系統(tǒng)照相，對(duì)比結(jié)果發(fā)現(xiàn)后者的結(jié)果更加清晰明顯，背景也更加干凈，之后就一直用成像儀曝光照相了。
2.夾取膠片可用普通鑷子，但也只夾膠片左上角，避免損害膠片上曝光的蛋白條帶。
3.膠片左上角maker一側(cè)一定要剪一小角或做其它標(biāo)記，才可在顯影后明顯對(duì)應(yīng)各個(gè)樣品。
4.若暗室曝光，可能內(nèi)參蛋白發(fā)光液剛加上就出現(xiàn)很亮的條帶，這時(shí)最長(zhǎng)曝光15s已經(jīng)足夠。
（十）膜重生：
若顯影效果不好，可將膜重生，再次顯影，省去了配膠、電泳和電轉(zhuǎn)等步驟。
1.加4ml蛋白印跡膜再生液，室溫?fù)u床30min。
- 1×TBST洗3次，每次10min。
3.5% BSA或5%牛奶封閉2h。
4.一抗4℃孵育過(guò)夜。
5.次日1×TBST洗三次，每次10min。
6.二抗孵育2h。
7.1×TBST洗三次，每次10min，曝光成像。
（本實(shí)驗(yàn)室使用的100×TBST、二抗和白印跡膜再生液均購(gòu)自***公司）
但是我實(shí)驗(yàn)幾次膜重生后的結(jié)果并不理想，所以還是乖乖從頭開(kāi)始做WB。
