測序原理
一代測序
sanger測序：雙脫氧鏈終止法
由于ddNTP的2’和3’都不含羥基，其在DNA的合成過程中不能形成磷酸二酯鍵，因此可以用來中斷DNA合成反應。在4個DNA合成反應體系中分別加入一定比例帶有放射性同位素標記的ddNTP，得到片段大小不一致的DNA混合物，然后通過凝膠電泳分離和放射自顯影后識別確定待測分子的DNA序列。
特點：金標準，人類基因組計劃應用一代測序完成
二代測序
Roche公司的454技術(shù)、Illumina公司的Solexa技術(shù)和Life technologies（ABI）公司的SOLiD技術(shù)；Life technologies公司的Ion Torrent和Ion Proton技術(shù)等，經(jīng)過不斷的競爭，454、SOLiD 和Helicos平臺不再開發(fā)新的儀器，Illumina平臺最終成為市場主流，其方法為邊合成邊測序。
1.DNA文庫構(gòu)建
將基因組DNA隨機片段化，然后通過末端修復、磷酸化、加A等步驟修補成平末端，最后加上特定的接頭（Adaptor），構(gòu)建成DNA文庫。
2.簇的生成——橋式PCR
Flowcell ：流動池，就是一張芯片，如Hiseq2500有2張flowcell，即一次運行的測序量
Lane：每張flowcell上通常都有多個通道，每個通道可以單獨測不同的樣品。
Flowcel上面連有兩種接頭（P5、P7），當DNA經(jīng)變性后流經(jīng)Flowcell時，利用Flowcell上的接頭與DNA兩端的接頭相互匹配。DNA進行橋式PCR擴增，從而將堿基信號放大。通過橋式PCR不斷循環(huán)獲得上百萬條成簇分布的雙鏈待測片段。
3.測序
4.數(shù)據(jù)產(chǎn)出
特點：通量高、時間短、讀長短。
三代測序
單分子測序技術(shù)原理
SMRT技術(shù)：
也采用邊合成邊測序方法，以SMRT芯片為測序載體，芯片上眾多小孔中的DNA聚合酶和模板結(jié)合，4色熒光標記4種堿基（dATP,dTTP,dCTP,dGTP)，在堿基配對階段，加入不同堿基會發(fā)出不同的光，根據(jù)光的波長與峰值可判斷進入的堿基類型。另外，若堿基存在修飾，則通過聚合酶的速度會減慢，因此可以通過檢測相鄰兩個堿基之間的測序時間、兩峰之間的距離來檢測甲基化等堿基修飾情況。SMRT測序速度快（每秒約數(shù)個dNTP），但是，測序錯誤率也較高（達到15%，可通過多次測序進行有效的糾錯）。
Complete Genomics公司的復合探針-錨定連接技術(shù)：
這項技術(shù)有點像升級版的SOLiD系統(tǒng)，但比之更復雜，這次是一次性結(jié)合9個堿基，只有第五個堿基是確定的A、T、C或G，而其他8個堿基則是隨機的。所以每個探針的長度是9個堿基，熒光種類還是4種，有每個探針的第五個堿基的種類確定。具體過程如圖。
納米孔單分子測序技術(shù)：
納米孔測序理論自1989年被提出以來，歷經(jīng)近三十年的發(fā)展，終于從理論到商業(yè)化并得到越來越廣泛地應用。該技術(shù)的原理是當在膜兩側(cè)施加電壓，分子馬達驅(qū)動DNA分子通過納米孔，導致電荷發(fā)生變化，每種堿基引起的電流變化是不同的，通過檢測這些電流進而轉(zhuǎn)化為對應的堿基序列。
Ion Torrent電子流檢測技術(shù)
這也是新一代測序技術(shù)中并不用到熒光檢測的一種，它檢測的是在合成過程中，不同堿基加入而釋放出的不同強弱的離子流。
特點：無需PCR擴增，讀長長，精準、高效
