在碩士就讀期間，就已經(jīng)做過 GWAS 相關(guān)的分析。當(dāng)時標(biāo)記量非常少， windows 系統(tǒng)分析就足夠了，作圖方面涉及的腳本也基本是蔡師兄幫寫的。后來，隨著高通量測序成本的降低，標(biāo)記數(shù)量越來越多，不得不進(jìn)入 linux 和 腳本操作的時代，因此我也陸陸續(xù)續(xù)的學(xué)習(xí)了 R 和 Python等編程語言，但是在編程的世界里，只是一個小菜鳥，大部分的腳本都是“借來的”。
而此次 GWAS方面的相關(guān)內(nèi)容基本取材于百邁客云課堂。
1、基本概念
全基因組關(guān)聯(lián)分析（Genome wide association study，GWAS）是對多個個體在全基因組范圍的遺傳變異（標(biāo)記）多態(tài)性進(jìn)行檢測，獲得基因型，進(jìn)而將基因型與可觀測的性狀，即表型，進(jìn)行群體水平的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，根據(jù)統(tǒng)計(jì)量或顯著性 p 值篩選出最有可能影響該性狀的遺傳變異（標(biāo)記），挖掘與性狀變異相關(guān)的基因。
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相對于連鎖分析的優(yōu)勢
? 關(guān)聯(lián)定位的相對優(yōu)勢：
? 1）分辨率高（單堿基水平）
? 2）研究材料來源廣泛，可捕獲的變異豐富
? 3）節(jié)省時間
關(guān)聯(lián)分析的基礎(chǔ)-連鎖不平衡（LD）
當(dāng)位于某一座位的特定等位基因與另一座位的某一等位基因同時出現(xiàn)的概率大于群體中因隨機(jī)分布的兩個等位基因同時出現(xiàn)的概率時，就稱這兩個座位處于連鎖不平衡狀態(tài)（linkage disequilibrium）
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r2 和 D'
? r2和D’反映了LD的不同方面。r2包括了重組和突變，而D’只包括重組史。
D’能更準(zhǔn)確地估測重組差異，但樣本較小時，低頻率等位基因組合可能無法
觀測到，導(dǎo)致LD強(qiáng)度被高估，所以D’不適合小樣本群體研究；
? LD衰減作圖中通常采用r2來表示群體的LD水平；
? Haplotype Block中通常采用D’來定義Block；
? 遷移、突變、選擇、有限的群體大小以及其他引起等位基因頻率改變的因素都
會引起LD的改變。
LD衰減
? LD的衰減指位點(diǎn)間由連鎖不平衡到連鎖平衡的演變過程；
? LD的衰減距離決定關(guān)聯(lián)分析時所需標(biāo)記密度，也在一定程度上決定關(guān)聯(lián)分析的精度。
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Haplotype Block
? 單體型塊，即連鎖不平衡區(qū)域，是指同一條染色體上處于連鎖不平衡狀態(tài)的一段連續(xù)的區(qū)域
? 單體型塊分析可以用于篩選 tag SNP、確定候選基因的范圍等
image.png2、材料選擇與群體設(shè)計(jì)
材料選擇的基本原則
基本原則
1）遺傳變異和表型變異豐富
2）群體結(jié)構(gòu)分化不能過于明顯（如亞種以上,發(fā)生生殖隔離是不能做GWAS的）
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樣本量
非稀有變異中，對中等變異解釋率（10%左右）的位點(diǎn)的檢測功效要達(dá)到80%以上時，需要的樣本量在400左右
位點(diǎn)的效應(yīng)越低，需要的樣本量越大
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群體類型
?種質(zhì)資源材料
? 遺傳變異豐富，可以同時對多個性狀進(jìn)行分析
? 群體結(jié)構(gòu)復(fù)雜，稀有變異多，遺傳信息丟失明顯
?人工群體
? 包括F2、半同胞家系、動物遠(yuǎn)交群體、NAM群體、MAGIC群體和ROAM等群體類型。背景單純，檢測功效高；可以放大稀有變異
? 遺傳變異不夠豐富，重組事件有限，定位精度可能較低
表型調(diào)查
精確的表型檢測是關(guān)聯(lián)分析的關(guān)鍵
GWAS對數(shù)量性狀和質(zhì)量性狀都適用
? 數(shù)量性狀：多基因控制，能夠測量得到具體數(shù)值，符合正態(tài)分布；考慮到數(shù)量性狀受環(huán)境影響大，建議將所有材料在同一環(huán)境下培育或養(yǎng)殖，或者用多年多點(diǎn)的數(shù)據(jù)分開分析后綜合結(jié)果或取BLUP值作為性
狀值進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。
? 質(zhì)量性狀：單基因控制，無法用具體數(shù)值衡量，可轉(zhuǎn)換成0、1等表示，需注意每個群體選取近似的樣本。
? 分級性狀：表型分布類似質(zhì)量性狀，但實(shí)際受多基因控制（數(shù)量性狀），如抗性性狀，因此需要提供每一個個體精確的測量數(shù)據(jù)。
? 多指標(biāo)性狀：有多個指標(biāo)可以同時度量時，找出代表原表型數(shù)據(jù)變異的主成分因子，作為關(guān)聯(lián)分析的表型數(shù)據(jù)
標(biāo)記開發(fā)與分型
? 實(shí)驗(yàn)室常用標(biāo)記（SSR等）
? SNP芯片
? NGS開發(fā)SNP、small Indel、CNV、SV標(biāo)記
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縱深研究--基因克隆示例
材料：381份粳稻品種（熱帶和溫帶品種）
1、關(guān)于水稻谷粒大小的性狀，GWAS定位到7號染色體，SNP峰值所在地方注釋到11個基因；
2、對11個基因分別在稻穗、葉片和根系中做RT-PCR，只有第9個基因OsSPL13在稻穗中表達(dá)有差異；
3、OsSPL13基因蛋白表達(dá)的進(jìn)一步驗(yàn)證；
4、分析OsSPL13基因在水稻大粒和小粒之間的序列差異，包括SNP位點(diǎn)和小的indel；
5、通過轉(zhuǎn)基因找到影響OsSPL13基因表達(dá)相關(guān)的相關(guān)區(qū)域（5’UTR中的一個串聯(lián)重復(fù)序列）；
6、通過RNA干擾的方法將大粒品種GP579和小粒品種Dongjing中OsSPL13的表達(dá)量下調(diào)后會使水稻籽粒的長度和粒重都顯著降低；
7、篩選到1個Dongjing來源的glw7突變體，粒長和粒重比野生型均明顯降低；
8、通過chip-seq進(jìn)行OsSPL13調(diào)節(jié)下游基因的驗(yàn)證（結(jié)果未示）SRS5和DEP1。
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