?NGS腫瘤體細(xì)胞突變檢測
? ? ?可查閱2017年 FDA批準(zhǔn)的FoundationOne CDx?和MSK-IMPACT兩個(gè)組織樣本大Panel以及2018年CFDA批準(zhǔn)的國內(nèi)幾個(gè)小Panel的相關(guān)產(chǎn)品說明。另外對于cfDNA血漿樣本，目前除EGFR基因外，尚未有相關(guān)產(chǎn)品獲批。
接下來從樣本類型入手，對這兩種類型樣本相關(guān)NGS產(chǎn)品的主要注意事項(xiàng)進(jìn)行說明：
一. 腫瘤組織樣本WGS/WES/靶向 Panel測序產(chǎn)品：? ? ? ??
Part1----測序前：該產(chǎn)品/公司能否提供以下十一項(xiàng)內(nèi)容或說明？
（1.1）該產(chǎn)品是否包含腫瘤純度評(píng)估內(nèi)容：
? ? ? ? 腫瘤組織是不同亞型的腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞的混合物，原始送檢樣本中腫瘤細(xì)胞比例直接決定著最終檢測結(jié)果，尤其是因腫瘤細(xì)胞比例過低（<10%，MSK-IMPACT）時(shí)帶來的假陰性結(jié)果。所以不管是WES/WGS還是Panel靶向測序，在交付測序分析結(jié)果的同時(shí)也應(yīng)提供腫瘤純度評(píng)估結(jié)果；
（1.2）該產(chǎn)品是否為Tumor/Normal配對檢測：
? ? ? Tumor only型產(chǎn)品雖然報(bào)價(jià)低，但大部分公司下游生信分析方法尚不成熟，除了Foundation Medicine的Tumor only分析方法獲FDA批準(zhǔn)認(rèn)可外，其它相關(guān)公司更多是出于控制成本和占領(lǐng)市場而非檢測結(jié)果準(zhǔn)確性的角度考慮。
（1.3）該P(yáng)anel設(shè)計(jì)的內(nèi)含子區(qū)域及建庫測序方法 (見圖1)：
? ? ? Panel產(chǎn)品中內(nèi)含子區(qū)域的有無以及內(nèi)含子位置和數(shù)目決定了能不能進(jìn)行DNA層面的融合基因檢測以及融合基因檢測結(jié)果的可靠性；
? ? ? 建庫測序方法---擴(kuò)增子建庫or雜交捕獲建庫：基于雜交捕獲法得到的NGS測序數(shù)據(jù)相較于擴(kuò)增子測序數(shù)據(jù)往往具有較好的均一性，有利于下游生信分析，尤其是拷貝數(shù)變異和融合基因的檢測；同時(shí)擴(kuò)增子Panel增加或刪減個(gè)別基因都會(huì)影響到全局的引物擴(kuò)增效率，對于臨時(shí)增加或減少擴(kuò)增子Panel中基因數(shù)目的操作需要慎重對待；
（1.4）該產(chǎn)品的測序深度與突變檢測下限：
? ? ? Panel組織樣本的測序深度：（質(zhì)控后clean data）在500X~1000X之間即可，隨著測序深度增加，引入PCR重復(fù)序列的比例也隨之升高，無效數(shù)據(jù)大幅增加，對于體細(xì)胞突變檢測意義不大；
? ? ? 突變檢測下限：不管是1%，還是5‰，請對方同時(shí)提供該檢測下限的突變r(jià)eads支持?jǐn)?shù)目；
（1.5）該產(chǎn)品轉(zhuǎn)產(chǎn)前的驗(yàn)證報(bào)告：
? ? ? 根據(jù)該產(chǎn)品轉(zhuǎn)產(chǎn)前用于驗(yàn)證的標(biāo)準(zhǔn)品基因數(shù)目、突變位點(diǎn)數(shù)目，QC，數(shù)據(jù)覆蓋度均一性，人員操作的精密度以及驗(yàn)證結(jié)果的PPV,NPV等情況對該產(chǎn)品性能有基本了解。
（1.6） 該產(chǎn)品檢測內(nèi)容：
? ? ? ? 一個(gè)設(shè)計(jì)良好的組織樣本NGS產(chǎn)品可以對點(diǎn)突變（SNV）、插入缺失? ? ? ? ? （insert/deletion）、拷貝數(shù)變異（CNV），基因融合，微衛(wèi)星不穩(wěn)定（MSI）五部分內(nèi)容進(jìn)行檢測，而且每部分都應(yīng)有對應(yīng)的檢測下限；
? ? ? ?此外，對于具有家族病史的腫瘤患者，還應(yīng)將其體細(xì)胞突變和配對的Normal樣本中的germline突變結(jié)合起來進(jìn)行分析，去年癌癥癌癥圖譜計(jì)劃發(fā)表的兩篇文章進(jìn)一步顯示癌癥患者中存在germline致病突變的比例（~8%）不容忽視：見?cell1,cell2，進(jìn)一步回應(yīng)了經(jīng)典的腫瘤二次打擊學(xué)說,這就是經(jīng)典學(xué)說的魅力吧！
(1.7)? 該產(chǎn)品變異檢測的其它備選方法（見圖2）：
? ? ? 目前不同主流體細(xì)胞突變檢測軟件的突變檢出一致率并不高，非主流突變檢測軟件更難稱得上靠譜，所以重要項(xiàng)目同時(shí)用兩套以上分析方法進(jìn)行分析還是有必要的。
(1.8)? 技術(shù)人員資質(zhì)及用藥數(shù)據(jù)庫建設(shè)及更新情況
? ? ? 避免自己成為----專業(yè)背景不對口、缺乏相關(guān)工作經(jīng)驗(yàn)的后臺(tái)技術(shù)人員推出的這個(gè)新產(chǎn)品的小白鼠；
(1.9) 建庫前的捕獲測序以及樣本特性（FFPE石蠟切片）等引入的假陽性突變
? ? ? ?高深度的靶向捕獲測序探針覆蓋的均一性、捕獲過程中的DNA損傷以及FFPE樣本（比如2年以上）的處理和儲(chǔ)存過程引起的核酸損傷和降解，導(dǎo)致的生信分析結(jié)果中出現(xiàn)大量的GA/CT假陽性突變,以及與測序平臺(tái)相關(guān)的背景噪音--大量樣本中普遍存在的低豐度突變，如何解決？
（1.10）有沒有定期的質(zhì)量驗(yàn)證和糾正措施
? ? ? ? 基因測序公司的人員流動(dòng)性普遍比較大，即便以上內(nèi)容全都做的很到位，還需要有良好的規(guī)章制度，比如定期的自行驗(yàn)證報(bào)告，以保證不同人員批次產(chǎn)品結(jié)果的穩(wěn)定；
（1.11） X10測序平臺(tái)的同line污染如何應(yīng)對
? ? ?大部分小公司都會(huì)把測序業(yè)務(wù)外包給具有 illumina X10測序平臺(tái)的大公司，但X10平臺(tái)建庫過程中樣本預(yù)混合時(shí)間相對其它測序平臺(tái)較長，同一條line的不同樣本在預(yù)混合過程中barcode脫落引起的樣本間的相互污染(?但不確定后來illumina很快推出的Novoseq平臺(tái)是否已經(jīng)解決該問題）,如何應(yīng)對？
Part2---測序后：樣本質(zhì)控信息及突變注釋數(shù)據(jù)庫版本
（2.1）組織樣本測序數(shù)據(jù)質(zhì)控信息應(yīng)包括：
? ? ? ? a. 插入片段長度的均值/中位數(shù)；b. GC比例及均一性分布圖；c. 樣本間交叉污染評(píng)估（防止錯(cuò)配及其它樣本污染）；d. bam文件靶區(qū)域覆蓋度的均值/中位數(shù)；e. 其它Q30等指標(biāo)
（2.2） 用于突變注釋的數(shù)據(jù)庫版本
? ? ? ??COSMIC/ClinVar等重要數(shù)據(jù)庫每年都會(huì)更新多版，這些數(shù)據(jù)庫直接影響著突變致病性的解讀，需要及時(shí)更新，另外也需要及時(shí)引入其它數(shù)據(jù)庫對常規(guī)數(shù)據(jù)庫中未收錄的非同義突變的致病性進(jìn)行預(yù)測。
?二. cfDNA樣本Panel產(chǎn)品
?Part1----測序前：該cfDNA產(chǎn)品是否能提供以下十項(xiàng)檢測內(nèi)容或說明：
2.1. 獲得CAP/CFDA認(rèn)證資格的公司與其產(chǎn)品靠譜的相關(guān)性有多大？
? ? ?一方面用于CAP/CFDA認(rèn)證考試的標(biāo)準(zhǔn)品位點(diǎn)的突變頻率相對較高；另一方面任何一家公司都會(huì)不計(jì)成本地投入人力、物力做好標(biāo)準(zhǔn)品以拿到這些證書；最后標(biāo)準(zhǔn)品跟實(shí)際樣本往往區(qū)別很大，所以拿到這些證就像考研過了國家線，與其實(shí)際科研解決問題的能力不存在必然聯(lián)系；
2.2. 采血比采組織樣本方便，直接用血液樣本的NGS結(jié)果代替組織樣本？
? ? ? 發(fā)文章可以，做biomarker篩選最好不要這樣干，2018年的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的cfDNA和組織樣本體TMB/bTMB的一致性也僅在0.64左右，其突變位點(diǎn)檢出的一致性更低，建議有組織樣本就盡量用組織樣本。2017年對國外主流ctDNA公司檢測結(jié)果的比較的研究報(bào)道以及2018年ASCO發(fā)布的ctDNA相關(guān)的臨床建議，都顯示當(dāng)前業(yè)內(nèi)對腫瘤ctDNA的臨床應(yīng)用價(jià)值還存在不少爭議。
2.3.? ?樣本融血影響大不大？
? ? ?輕度溶血需標(biāo)記備注，中度以及重度融血影響檢測結(jié)果，須重新送樣，此外血樣處理時(shí)間，采樣管材質(zhì)等眾多因素都會(huì)影響到ctDNA的檢測結(jié)果。
2.4. 是否需要血漿/白細(xì)胞配對檢測？
? ? ?當(dāng)前那些聲稱可以對cfDNA血漿樣本進(jìn)行非配對檢測的都是耍流氓；
2.5. cfDNA樣本的WGS/WES產(chǎn)品是否靠譜？
? ? ? ?某些癌種在科研上有對cfDNA進(jìn)行WGS/WES測序分析的例子，但實(shí)際生產(chǎn)中必然存在較大范圍漏點(diǎn)（捕獲不到，測不到）的情形；
2.6. cfDNA/組織樣本體細(xì)胞突變檢測是否同時(shí)應(yīng)設(shè)置檢測上限 [見圖3]？
? ? ? ?由于腫瘤組織的異質(zhì)性，攜帶特定體細(xì)胞突變的腫瘤細(xì)胞在組織中的占比介于0%-100%之間，因此不管是cfDNA還是組織樣本，從保證結(jié)果特異性的角度出發(fā)對體細(xì)胞突變設(shè)置檢測下限是有必要的，但是設(shè)置檢測上限是沒有根據(jù)的，其背后可能反映著生信分析流程的bug以及后臺(tái)技術(shù)人員的不專業(yè);
2.7. cfDNA Panel建庫測序的UMI分子標(biāo)簽及測序深度
? ? ? ?cfDNA必須加UMI建庫測序（組織則樣本沒必要），以減少低頻突變假陽性位點(diǎn)的干擾，另外UMI深度及支持?jǐn)?shù)目應(yīng)體現(xiàn)在下游質(zhì)控分析和變異檢測結(jié)果中；
? ? ? ?根據(jù)2016年的文獻(xiàn)及業(yè)內(nèi)主流公司產(chǎn)品，cfDNA樣本測序深度應(yīng)在20,000X以上；
2.8.? 請對方同時(shí)提供cfDNA產(chǎn)品轉(zhuǎn)產(chǎn)前驗(yàn)證報(bào)告及ctDNA與組織樣本突變檢測一致性報(bào)告
? ? ? ?GIAB官網(wǎng)提供的標(biāo)準(zhǔn)品中的已知位點(diǎn)畢竟有限，有一定樣本積累公司會(huì)對ctDNA與組織樣本突變檢出一致率進(jìn)行比較，從整體層面對自己cfDNA產(chǎn)品做一個(gè)評(píng)估；
2.9.? 請對方提供白細(xì)胞克隆造血等特殊情況的解決方案
? ? ? ? 約5%~10%的老年人會(huì)發(fā)生克隆性造血---血液中存在低豐度的克隆性造血相關(guān)基因突變，這些突變往往難以與腫瘤特有突變進(jìn)行區(qū)分；
2.10. 請對方提供檢測內(nèi)容及各項(xiàng)檢測內(nèi)容的檢測下限
? ? ? ?目前無法從cfDNA層面檢測微衛(wèi)星不穩(wěn)定（MSI）,在拷貝數(shù)變異（CNV）檢測方面也無法通過評(píng)估cfDNA中ctDNA比例來估計(jì)腫瘤細(xì)胞占比；其它基因融合及insert/deletion檢測也往往沒有組織樣本準(zhǔn)確；
?Part2: 測序后：數(shù)據(jù)質(zhì)控及突變檢測結(jié)果IGV驗(yàn)證
數(shù)據(jù)質(zhì)控：除reads測序深度外，必須同時(shí)提供UMI深度信息，其它質(zhì)控條件同組織樣本；
突變檢測結(jié)果IGV驗(yàn)證：cfDNA突變檢測難度較大，結(jié)果容易出現(xiàn)假陽性突變，因此對于最終檢測結(jié)果的可靠性，需同時(shí)索要用于變異檢測的bam及索引文件，在windows本地安裝的IGV基因組瀏覽器上對SNV/INDEL以及融合基因進(jìn)行驗(yàn)證，最后突變注釋相關(guān)注意事項(xiàng)同組織樣本。
三. 實(shí)際項(xiàng)目中的一些常見疑問
Q1: 同一個(gè)病人不同時(shí)間點(diǎn)上的體細(xì)胞突變檢測，配對Normal樣本是否需要多次采樣測序？
? ? ? ? 對于具備較好技術(shù)積累和運(yùn)營透明度的測序公司，Normal樣本的germline突變在不同批次建庫測序分析中不會(huì)有大的起伏，配對Normal樣本只測一次即可；
Q2:同一個(gè)病人在不同時(shí)間點(diǎn)上cfDNA樣本的體細(xì)胞突變檢測結(jié)果無交集？
? ? ? 同一個(gè)cfDNA樣本不同文庫的測序分析結(jié)果是會(huì)存在差異，但是如果入組的多個(gè)個(gè)體都在不同時(shí)間點(diǎn)上的體細(xì)胞突變都沒有交集，則需考慮質(zhì)控以及該產(chǎn)品是否存在bug，可換一家公司對原始數(shù)據(jù)重新分析；
Q3： 結(jié)題報(bào)告中的結(jié)果與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及預(yù)想結(jié)果出入較大：
? ? ? 不用急著否定自己的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，先把原始數(shù)據(jù)換一家公司重新分析一遍，著重比較數(shù)據(jù)質(zhì)控和突變檢測兩部分內(nèi)容；
Q4：Panel大小與TMB及突變檢出數(shù)目的相關(guān)性？（見圖4）
? ? ? ? 如圖4所示：外顯子總長度在1Mb以上（基因數(shù)目約300個(gè)以上）的Panel，其TMB值與WES數(shù)據(jù)有較好的一致率。同時(shí)大Panel在腫瘤純度、染色體倍性評(píng)估以及相關(guān)的拷貝數(shù)變異分析上也會(huì)有較準(zhǔn)確的結(jié)果；
Q5: 關(guān)于合同上經(jīng)常出現(xiàn)的數(shù)據(jù)量及測序深度：
? ? ? 一味吹噓測序數(shù)據(jù)量大、測序深度高的的產(chǎn)品往往水分比較大--這是實(shí)在拿不出其它硬性技術(shù)指標(biāo)的節(jié)奏；另外對于測序深度，最好分清楚是raw data、clean data、重后的bam文件還是UMI深度這四個(gè)中的哪一個(gè)；
Q6: 腫瘤驅(qū)動(dòng)突變、免疫組庫技術(shù)、腫瘤疫苗、ctDNA甲基化早篩等前沿技術(shù)產(chǎn)品？
? ? ? ?及時(shí)跟進(jìn)，暫不做評(píng)價(jià)
? ? ? NGS腫瘤體細(xì)胞突變檢測部分的注意事項(xiàng)暫且寫到這里，相關(guān)內(nèi)容會(huì)持續(xù)更新，RNA-seq及溶瘤病毒denovo組裝部分內(nèi)容見后續(xù)章節(jié)。希望能對藥企/轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中涉及NGS的相關(guān)研究有所幫助。同時(shí)也歡迎大家交流執(zhí)指正！
?寫于 2019年3月12日夜
