摘要

背景：白細(xì)胞介素17家族細(xì)胞因子是癌癥（CRC）發(fā)展的有力驅(qū)動因素。已經(jīng)表明，IL-17主要向腫瘤細(xì)胞發(fā)出信號以促進(jìn)CRC，但其潛在機制尚不清楚。IL-17也抑制Th1武裝的抗腫瘤免疫，部分是通過吸引骨髓細(xì)胞進(jìn)入腫瘤。然而，IL-17是否以更直接的方式控制適應(yīng)性免疫細(xì)胞的活性尚不清楚。

方法：使用散發(fā)性或誘導(dǎo)性結(jié)直腸癌的小鼠模型，我們在全身或特異性結(jié)直腸癌細(xì)胞中消融IL-17RA。我們還進(jìn)行了過繼性骨髓重建，以敲除造血細(xì)胞中的CXCR3。組織學(xué)和免疫學(xué)實驗方法用于揭示IL-17、趨化因子產(chǎn)生和CRC發(fā)展之間的聯(lián)系。

結(jié)論：IL-17向結(jié)直腸癌細(xì)胞發(fā)出信號并抑制其CXCL9/10趨化因子的產(chǎn)生。通過這樣做，IL-17抑制CD8+CTL和Tregs向CRC的浸潤，從而促進(jìn)CRC的發(fā)展。癌癥免疫療法可通過使用抗IL-17藥物作為輔助療法而受益，這些藥物可阻斷IL-17介導(dǎo)的腫瘤促進(jìn)和T細(xì)胞排斥

1.IL-17 inhibits the infiltration of tumor-associated CD4+ T cells and the production of IL-10 and TGF-β

IL-17抑制腫瘤相關(guān)CD4+T細(xì)胞的浸潤及IL-10和TGF-β的產(chǎn)生

使用散發(fā)性和誘導(dǎo)性CRC的小鼠模型，我們開始了解IL-17如何調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫。散發(fā)性CRC的小鼠模型基于結(jié)腸上皮細(xì)胞中一個拷貝的Apc腫瘤抑制基因的等位基因失活，該基因由Cdx2Cre轉(zhuǎn)基因（Cdx2Cre+/ApcF/+）驅(qū)動。隨后的Apc雜合性缺失（LOH）導(dǎo)致腸道中大結(jié)腸腺瘤和腺癌的發(fā)展。該模型中的腫瘤僅限于結(jié)腸和直腸，并發(fā)展為腺癌，這使得該模型與人類CRC比常用的ApcMIN小鼠更相關(guān)，因為大多數(shù)腫瘤都在小腸中發(fā)展。作者還使用了第二種同步結(jié)直腸腫瘤發(fā)生模型[25]，該模型依賴于他莫昔芬誘導(dǎo)的Cdx2-Cre-ERT2+/ApcF/F小鼠中Apc基因的消融，從而可以研究早期結(jié)直腸腫瘤的發(fā)生。早期CRC病變可在注射他莫昔芬后1周進(jìn)行組織學(xué)檢查。如果沒有中斷，這些早期病變在4周后發(fā)展為可見的結(jié)直腸腫瘤。使用這些工具，我們發(fā)現(xiàn)IL-17抑制IL-10和TGF-β的產(chǎn)生，這兩種物質(zhì)都限制Th17活性并抑制CRC的發(fā)展。IL-10和TGF-β由腫瘤內(nèi)的多種免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生，包括Tregs。在散發(fā)性CRC模型中，IL-17RA的消融導(dǎo)致Foxp3水平升高，F(xiàn)oxp3是Tregs的關(guān)鍵標(biāo)志物（F1A）。由于作者之前的研究表明IL-17對早期CRC病變的生長至關(guān)重要，作者還檢測了直徑僅為1至2mm的早期CRC腫瘤中IL-10和TGF-β1的水平。IL-17信號傳導(dǎo)的消融導(dǎo)致IL-10和TGF-β1mRNA水平顯著增加（超過10倍）（F1B），并顯著誘導(dǎo)腫瘤中Foxp3的表達(dá)（F1B），表明IL-17信號在早期CRC抑制抗炎細(xì)胞因子產(chǎn)生中發(fā)揮重要作用。TGF-β1由腫瘤微環(huán)境中的多種細(xì)胞類型產(chǎn)生，而IL-10的產(chǎn)生似乎僅限于CD4+T細(xì)胞（F1C）。在早期CRC病變、IL-17信號傳導(dǎo)的消融導(dǎo)致CD4+T細(xì)胞向腫瘤的募集增加，以及Foxp3+（Tregs）或Foxp3-（Tr1細(xì)胞）的IL-10+CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)量增加（F1D、E）。這些數(shù)據(jù)表明，IL-17在早期CRC中抑制Treg細(xì)胞的浸潤和抗炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生。

2.IL-17 inhibits the infiltration of CTLs in early stage CRC

IL-17抑制早期CRC中CTL的浸潤

作者之前已經(jīng)表明，IL-17抑制Th1/Tc1特征基因的表達(dá)。這可能是由于IL-17介導(dǎo)的對CD8+CTL向CRC滲透的抑制。事實上，冷凍切片結(jié)腸腫瘤的免疫染色顯示，IL-17RA的消融導(dǎo)致散發(fā)性結(jié)腸腫瘤中CD8+T細(xì)胞數(shù)量的顯著增加（F2A、B）。為了測試IL-17對CTL浸潤的抑制是否發(fā)生在早期CRC中，我們對三苯氧胺誘導(dǎo)的結(jié)腸上皮Apc缺失后發(fā)生的腫瘤進(jìn)行了流式細(xì)胞術(shù)分析。該模型中IL-17RA的缺失也導(dǎo)致腫瘤中CD8+CTL數(shù)量的顯著增加（圖2c），證明了IL-17信號在限制早期結(jié)腸腫瘤中CTL浸潤中的抑制作用。失去IL-17RA的早期腫瘤也表現(xiàn)出IFN-γ和TNF-α的表達(dá)升高（圖2d）。IL-17信號傳導(dǎo)對T細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ和TNF-α沒有直接影響（圖2e）。由于CD8+CTL長期以來已知在癌癥免疫監(jiān)測中發(fā)揮作用，觀察到的IL-17對CD8+T細(xì)胞浸潤的抑制與IL-17在促進(jìn)早期CRC發(fā)展中的作用一致。

3.IL-17 suppresses the expression of CXCL9,10, and 11

已知IL-17可促進(jìn)趨化因子的產(chǎn)生和MDSCs對腫瘤的吸引力。小鼠IL-17RA的消融導(dǎo)致腫瘤內(nèi)CXCL1和2水平降低。與IL-17在促進(jìn)CXCL1/2產(chǎn)生和骨髓細(xì)胞募集中的已知作用一致。IL-17是否調(diào)節(jié)T細(xì)胞募集尚不清楚。我們發(fā)現(xiàn)IL-17信號傳導(dǎo)的缺失導(dǎo)致結(jié)腸腫瘤中T細(xì)胞趨化因子CXCL9、10和11的水平增加（F3a,b）。IL-17信號傳導(dǎo)的缺失也增加了CXCR3的表達(dá)，CXCR3是CXCL9/10/11趨化因子的同源受體，可能反映了表達(dá)CXCR3淋巴細(xì)胞向腫瘤的募集增加（F3a）。在接受抗IL-17A中和抗體腹膜內(nèi)注射的小鼠的5個月大的CRC腫瘤中也觀察到趨化因子CXCL9家族的上調(diào)，證明了急性IL-17A阻斷對趨化因子產(chǎn)生的影響（F3C）。與IL-17在CRC早期抑制T細(xì)胞浸潤的觀點一致，誘導(dǎo)的結(jié)直腸腫瘤發(fā)生的小鼠模型導(dǎo)致早期CRC腫瘤中CXCL9家族趨化因子升高（F3D）。

4.IL-17 signals to transformed colonic epithelial cells to suppress the production of CXCL9, 10, and 11

作者之前已經(jīng)表明，IL-17主要向轉(zhuǎn)化的結(jié)腸上皮細(xì)胞（腫瘤細(xì)胞）發(fā)出信號，以促進(jìn)CRC的發(fā)展[1]。同樣的信號通路也可能控制CXCL9家族趨化因子的產(chǎn)生。為此，我們分析了CXCL9家族趨化因子在攜帶IL-17RA的結(jié)腸上皮細(xì)胞特異性缺失的Cdx2Cre+/ApcF/WT小鼠中的表達(dá)。IL17信號的丟失，對于結(jié)腸上皮和他們的轉(zhuǎn)化導(dǎo)致了CXCL9家族趨化因子的表達(dá)上調(diào)（F4a）。為了證實IL-17對趨化因子產(chǎn)生的直接抑制作用，我們從Cdx2 Cre ERT+/ApcF/F小鼠中分離出腫瘤細(xì)胞，并在Matrigel中培養(yǎng)這些細(xì)胞以形成腫瘤球體。用重組IL-17A、C或F處理這些腫瘤球，然后通過q-RT-PCR分析趨化因子的表達(dá)。與先前已知的IL-17在促進(jìn)骨髓細(xì)胞趨化因子產(chǎn)生中的作用一致，用重組IL-17治療導(dǎo)致CXCL1和2水平升高（F4B）。然而，在原發(fā)性腫瘤球體中，IL-17刺激導(dǎo)致CXCL9和10mRNA水平降低（F4B），從而證實了IL-17對CXCL9/10產(chǎn)生的直接抑制作用。

5.CXCR3 signaling attracts CTLs and Treg cells to inhibit CRC development

CXCL9和10由腫瘤細(xì)胞和腫瘤過濾髓系細(xì)胞表達(dá)，其受體CXCR3僅限于T淋巴細(xì)胞（F5A）。我們推斷，這種趨化因子途徑可能是IL-17在T細(xì)胞遷移到CRC中的抑制作用的原因。事實上，通過骨髓重建的方式消融所有血細(xì)胞中的CXCR3導(dǎo)致CD8+T細(xì)胞的募集減少，并且在較小程度上導(dǎo)致Tregs向結(jié)直腸腫瘤的募集減少（F5B、C）。血細(xì)胞中CXCR3的消融也降低了腫瘤中IL-10和TGF-β的水平（圖5d），這兩種物質(zhì)都被證明可以通過抑制促瘤炎癥來抑制CRC的發(fā)展。CXCR3消融也導(dǎo)致腫瘤中Foxp3水平的顯著降低（圖5d），表明CXCR3缺失后Treg募集減少。造血細(xì)胞中的CXCR3信號傳導(dǎo)對于Th1、Th17和髓系細(xì)胞向結(jié)直腸腫瘤的募集是可有可無的（SF1）。骨髓細(xì)胞中CXCR3的消融對腫瘤中IL-17的表達(dá)沒有影響，并導(dǎo)致IFN-γ水平升高（F5D）。CXCR3的缺失也不影響腫瘤浸潤性T細(xì)胞的活化和擴增（SF2）。與已知的CD8+CTL在限制癌癥發(fā)展中的作用一致，在缺乏CD8α或Beta-2微球蛋白（MHC I復(fù)合物的亞基）的小鼠中，這些細(xì)胞的缺失均導(dǎo)致大腸腫瘤發(fā)展升高（附加文件1:F I g u r e S3a，b）。鑒于CXCR3在介導(dǎo)CD8+CTL和Treg募集中的作用，我們推斷CXCR3的缺失也應(yīng)導(dǎo)致結(jié)直腸腫瘤的加速發(fā)生。事實上，在造血細(xì)胞中缺乏CXCR3的小鼠發(fā)展出更多的結(jié)直腸腫瘤，而腫瘤大小沒有變化（圖5e）。CXCL9家族趨化因子的表達(dá)水平不受攜帶CRC的小鼠中CD8+T細(xì)胞損失的影響（附加文件1：圖S3c），這表明這些細(xì)胞不是產(chǎn)生CXCL9家庭趨化因子所必需的?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明CXCR3信號選擇性地將CD8+CTL和Tregs吸引到CRC，并抑制CRC的發(fā)展。

6.IL-17 blockade upregulates the expression of immune

checkpoint markers

免疫檢查點抑制劑，如阻斷CTLA-4和PD-1信號傳導(dǎo)的抗體，僅對一小部分顯示微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI）的結(jié)直腸癌有效。鑒于IL-17在抑制CTL和Treg細(xì)胞向CRC浸潤中的作用，我們接下來測試了其阻斷是否會影響免疫檢查點信號傳導(dǎo)。小鼠散發(fā)性腫瘤模型中IL-17RA的消融導(dǎo)致CTLA-4的表達(dá)升高（F6A），這是一種在Tregs中組成性表達(dá)的細(xì)胞表面蛋白，介導(dǎo)其部分免疫抑制功能。此外，IL17RA無效腫瘤還表現(xiàn)出PD-L1和PD-L2的表達(dá)水平升高（F6A）。在用抗IL-17A的中和抗體處理的Cdx2-Cre+/ApcF/WT小鼠中觀察到類似的變化（F6B）。在早期結(jié)直腸腫瘤發(fā)生的小鼠模型中也觀察到CTLA-4和PD-1通路標(biāo)記物的上調(diào)（F6C），表明IL-17和免疫檢查點通路的拮抗作用始于CRC發(fā)展的早期階段。我們之前已經(jīng)證明，IL17RA的消融導(dǎo)致了INF-γ，其可以上調(diào)PD-L1的表達(dá)。IL-17信號傳導(dǎo)不影響腫瘤浸潤性CD4+和CD8+T細(xì)胞的增殖或活化（F6D）。腫瘤浸潤性CD8+和CD4+T細(xì)胞都表達(dá)PD-1，并且PD-1陽性T細(xì)胞的比例在IL-17信號傳導(dǎo)消融后適度降低（F6D）。因此，CRC中總體PD-1表達(dá)的增加可能反映了IL-17信號傳導(dǎo)阻斷后T細(xì)胞浸潤的顯著增加，而不是每個細(xì)胞的PD-1表達(dá)增加。CTLA-4免疫療法已在人類癌癥中進(jìn)行了測試，并顯示出不同的療效。與Tregs在限制腫瘤相關(guān)炎癥中的作用一致，抗體阻斷CTLA-4信號傳導(dǎo)增加了腫瘤中IL-17A的表達(dá)（F7A）。相反，在接受PD-1阻斷抗體的小鼠中，IL-17的表達(dá)沒有改變（F7B）。這些結(jié)果表明，CTLA-4阻斷上調(diào)結(jié)直腸腫瘤中的促腫瘤IL-17?？傊?，我們的數(shù)據(jù)顯示，IL-17向腫瘤細(xì)胞發(fā)出信號，下調(diào)趨化因子CXCL9/10的產(chǎn)生，這是將CD8+CTL和Tregs吸引到CRC所必需的。IL-17對CXCL9/10信號傳導(dǎo)的抑制因此降低了抗癌免疫的活性，并促進(jìn)更強的促腫瘤炎癥（F7C）。

Conclusions

我們的數(shù)據(jù)顯示了IL-17在抑制CD8+CTL和Tregs向CRC浸潤中的新作用。這是由IL-17向結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞的信號傳導(dǎo)介導(dǎo)的，這導(dǎo)致CXCL9/10趨化因子的產(chǎn)生減少。CXCL9/10趨化因子通過其同源受體CXCR3發(fā)出信號，將CD8+CTL和Tregs募集到CRC，但對于其他T細(xì)胞和髓系細(xì)胞的募集或激活是可有可無的。通過將Tregs和CTL排除在CRC之外，IL-17促進(jìn)了腫瘤促進(jìn)炎癥的主導(dǎo)地位。為此，癌癥免疫療法可能受益于抗IL-17藥物的使用，因為阻斷IL-17降低了腫瘤生長速率并增加了CTL的浸潤，這對有效的癌癥治療至關(guān)重要。