一、 目的：
掌握逆轉(zhuǎn)錄和半定量PCR的基本原理和操作過(guò)程。
二、原理：
1.逆轉(zhuǎn)錄的基本原理
提取組織或細(xì)胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，采用Oligo(dT)或隨機(jī)引物利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA。
2.半定量PCR的基本原理
是近年來(lái)常用的一種簡(jiǎn)捷的定量RNA測(cè)定方法，通過(guò)mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增目的基因，并測(cè)定PCR產(chǎn)物的數(shù)量，可以推測(cè)樣品中特異mRNA的相對(duì)數(shù)量。需要將目的基因與管家基因（如β-actin）電泳條帶的相對(duì)含量進(jìn)行比較，觀測(cè)目的基因表達(dá)的強(qiáng)弱。
具有較高的靈敏性、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，常用于基因定量分析、生物學(xué)檢測(cè)等，此外常用逆轉(zhuǎn)錄PCR克隆目的基因。
3、電泳檢測(cè)：
1）用1×TBE電泳緩沖液制作2%瓊脂糖凝膠，加1×TBE電泳緩沖液覆蓋凝膠。
2）用微量移液器取PCR產(chǎn)物樣品5μl及1μl 的6×加樣緩沖液，混勻后，用微量移液器小心加入點(diǎn)樣孔。
3）打開(kāi)電源開(kāi)關(guān)，調(diào)節(jié)電壓至110V，使RNA由負(fù)極向正極電泳，約20min后將凝膠放在凝膠成像儀上觀察RNA電泳結(jié)果。
四、注意事項(xiàng)：
1、RNA抽提質(zhì)量要好；
2、注意污染和避免RNA降解；
3、內(nèi)參常用的有β-actin和GAPDH。
