0 摘要
反向遺傳學被認為是一種不可或缺的工具，它徹底改變了我們對病毒發(fā)病機制和疫苗開發(fā)的認識。大型的RNA病毒基因組，如冠狀病毒基因組，由于基因組較大且不穩(wěn)定，很難在大腸桿菌宿主中克隆和操作。
該研究團隊此次報道了一個基于酵母（Saccharomyces cerevisiae）的合成基因組學平臺，能夠根據(jù)已知病毒基因組，在合成基因片段（來源：病毒中提取、對病毒DNA的克隆、臨床的樣品或是人工合成的DNA）后一周內(nèi)，對新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）進行基因組重建、改造以及病毒拯救（virus secure），即實現(xiàn)無需從病人體內(nèi)分離病毒，直接使用酵母快速生產(chǎn)出大量有活性的新型冠狀病毒（由于技術(shù)原因并未完全實現(xiàn)）。除此之外，該團隊還對冠狀病毒科、黃病毒科和副粘病毒科的其它RNA病毒的基因組進行了重建和拯救，拯救的成功率可達90%以上。這一技術(shù)可對突然爆發(fā)的病毒疫情快速做出反應(yīng)，可以在爆發(fā)期間實時生成不斷發(fā)展的RNA病毒變體并對其功能進行表征，大大減少了因病毒變異給研究帶來的困難。
1 通訊作者介紹
兩位通訊作者均來自瑞士的University of Bern
2.1 研究背景—理論基礎(chǔ)
Transformation-Associated Recombination cloning? TAR克隆
基因組DNA片段和過量的TAR載體在去除細胞壁的酵母細胞中進行混合。每個載體中都含有對目的基因特異的兩段序列（標為藍色和紅色）以及酵母的篩選標記HIS3和CEN6（淡藍色原點）。由于載體過量，酵母細胞便會將DNA片段全部接受。根據(jù)具體情況又可分為三類：1）未分到基因組DNA的；2）分到基因組DNA但未被整合到TAR載體上的；3）分到基因組DNA且通過自身同源重組被整合到TAR載體上的。顯然我們是只需要第三種情況的陽性克隆，怎么把其它兩種過濾掉呢？答案是進行電泳。
下圖是對上述過程的簡化示意：
2.2?研究背景—首次實現(xiàn)
2010年5月20日，J. Craig Venter Institute在美國Science?雜志上報道了首例人造細胞的誕生。向山羊支原體?Mycoplasma capricolum?細胞中轉(zhuǎn)入人工合成的蕈狀支原體Mycoplasma mycoides?的基因組而來，產(chǎn)生的人造細胞表現(xiàn)出的是蕈狀支原體的生命特性。
3.1 SARS-CoV-2病毒的重建
3.1.1?SARS-CoV-2重建與SARS-CoV-2大流行關(guān)鍵事件的時間線
3.1.2 實驗流程概述
3.1.3 病毒拯救與活性檢測
利用該平臺，研究人員在拿到合成DNA片段后一周內(nèi)，對新冠病毒進行了基因組改造和病毒拯救。研究團隊于1月14日向試劑公司下單，以化學合成方式得到上述14個DNA片段，并在2月4日拿到其中的12個含片段載體（有pUC57、pUC19、pUC57mini和PCC1-His3）。其中片段5 和7 未獲得，原因不詳。研究團隊最終通過對一位來自慕尼黑患者的新冠病毒樣本（BetaCoV/Germany/BavPat/2020）進行RT-PCR 擴增，獲得了第5和第7個片段。
利用TAR 克隆，研究人員獲得了6 組正確組裝的新冠病毒構(gòu)建體的分子克隆。隨后用酵母的同源重組系統(tǒng)依據(jù)末端重復(fù)的序列將這些DNA 序列拼到一起。獲得完整的病毒序列后，用T7 RNA 聚合酶將其通過脫落轉(zhuǎn)錄，得到病毒RNA，將該RNA 用電穿孔技術(shù)導入到非洲綠猴腎細胞（VeroE6 cell）中，使其感染。將用于培養(yǎng)綠猴腎細胞（~2d），含釋放出的病毒顆粒的上清液注入到別的培養(yǎng)基中，發(fā)現(xiàn)可以感染別的細胞，說明新構(gòu)建的酵母合成平臺可以拯救病毒。
3.2 MHV與MARS-CoV的重建
同理，作者團隊在鼠肝炎病毒A59（MHV-A59）和MERS-CoV進行病毒拯救的測試，發(fā)現(xiàn)效果依舊很好，測試的克隆中正確組裝了病毒基因組的YAC均可達到90％，這表明病毒在酵母中的組裝效率相當之高。
4?小結(jié)
TAR 克隆系統(tǒng)的一個最重要的優(yōu)點就是可以先對全基因組進行設(shè)計，通過對小的具有重復(fù)序列的片段的合成，進而再依靠酵母的同源重組系統(tǒng)進行片段的正確組裝，極大的降低了合成的難度，也大幅提高了合成的效率。無需得到變異毒株的臨床樣本，通過對病毒變異的分析，可以合成構(gòu)建出該變異毒株的基因組片段，再通過酵母平臺進行重建與拯救。論文中還提到對局部片段的重新設(shè)計，以測試改變前后對病毒的影響。
總的來說，這一方法即利用酵母人工染色體在酵母體內(nèi)將合成的SARS-CoV-2的DNA片段進行體外重組，獲得全長cDNA克隆。再將cDNA體外轉(zhuǎn)錄為RNA，利用電穿孔將病毒RNA轉(zhuǎn)染進哺乳動物細胞，實現(xiàn)病毒拯救。
化學合成的基因組DNA所產(chǎn)生的SARS-CoV-2可以繞開病毒分離物的來源限制，而且還可以對單個基因進行遺傳修飾和功能表征。
5 后記
對于這一篇論文，我起初有許多地方不明白。
首先是病毒的基因組合成，理論上講，比病毒更高級的生物基因組，并不是沒有人合成出來過，因此這篇論文的技術(shù)可以說是降維打擊了，那為什么還可以發(fā)表在頂級雜志Nature上呢？
從時間線上進行分析，我們可以得知，1月11日病毒序列正式被公布（據(jù)我所知應(yīng)該是中國CDC發(fā)布的），但是國外第一個提取出病毒毒株的時間卻是到了2月26日，與序列的公布整整相差1個多月。我們也可以知道這次的Pandemic，一個多月可以新增多少感染者和死亡者，時間就是生命啊！而作者在序列公布后的第3天便下出了訂單，在ICTV正式公布新冠病毒名稱的第2天便得到了拯救完成的病毒?？梢韵胂?，如果以后沒有可能及時得到病毒的毒株，我們可以直接根據(jù)序列得到病毒的毒株，這是本篇文章最大的亮點之一，即在此類形勢下給人一種研究病毒的范式。
第二個亮點，可以關(guān)注到作者不僅做了SARS-CoV-2，還做了MHV和MARS-CoV?？床幻靼椎脑捊o個提示：這三種病毒都是冠狀病毒科（Coronaviridae ）的！此外，作者在表格中還列出未實現(xiàn)拯救的人呼吸道合胞病毒（hRSV-B）、寨卡病毒（ZIKA virus）和流感病毒（HCoV）。這意味著作者想通過對一系列冠狀病毒的拯救驗證來說明這一平臺廣泛的適用性，將難纏的冠狀病毒，乃至其他病毒的毒株獲取難度降低。這或許對科學界是件好事，但是可能也是件壞事吧…
拓展閱讀關(guān)鍵詞：
Craig Ventor；冠狀病毒亞基因組；
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參考文獻：
[1] Thao, et al.?Nature?,?2020.?
[2]?Natalay Kouprina & Vladimir Larionov.?Nat Protocol?, 2008.
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[4]?孫明偉, 李寅, 高福.?生物工程學報?, 2010.
