1.1. 制備樣品：
1.1.1. 裂解組織：
（1）RIPA（組織裂解液）+蛋白酶抑制劑（二者比例：100:1），根據(jù)組織大小加入裂解混合液。（以大腦海馬和皮層舉例，最后總共加入200ul和400ul）
（2）組織需要研磨，先加入100ul裂解混合液在冰上研磨，研磨完再補(bǔ)充裂解混合液至最終體積。
準(zhǔn)備工作：研磨棒需要清洗，先用自來(lái)水清洗——75%乙醇浸泡10min——純水清洗——晾干——裝盒
1.1.2. BCA法檢測(cè)蛋白濃度：
（1）19ul水+1ul樣品（三個(gè)重復(fù)），每個(gè)+BCA（A液：B液=50:1）（現(xiàn)用現(xiàn)配，每個(gè)孔+200ul并吹打，過(guò)程中注意勿起泡）。
（2）37℃培養(yǎng)箱放置30min后檢測(cè)濃度。
注意：使用相對(duì)定量法，需要根據(jù)濃度最低的樣本作為參考算出總量，然后算其他樣品的量和加入水的量。
1.1.3. 制樣
（1）樣品一般配置100ul——80ul（蛋白和水）+20ul loading
（2）處理樣品：100℃，5min，冰上冷卻 5min，離心機(jī)離心13000rpm 3min
上樣量：豐度高——10ul，豐度低——上樣量適量增多
1.2. SDS-PAGE電泳：
1.2.1. 選板子和梳子，組裝板子：
將板子和梳子都清洗干凈——烘干——冷卻至室溫（不可用紙擦干，否則會(huì)有小絨毛留在板子上）——組裝板子（兩塊板要齊，否則容易漏膠）。
1.2.2. 制膠：
（1）配制分離膠并加入板子（需要預(yù)留比梳子高的空間后續(xù)加入濃縮膠）——加異丙醇水封——聚合20-30min（此時(shí)可以配制1×電泳液和1×轉(zhuǎn)膜液（需要冰上冷卻））——ddH2O洗三遍，用吸水紙將殘余水分吸走，吸水紙不可觸碰到分離膠——加入濃縮膠——快速插入梳子——聚合20-30min。
1×電泳液：10×電泳液100ml，加水定容至1L，顛倒混勻15次。量筒用前要清洗，將電泳液倒入瓶子中后，可在量筒中加適量入水搖一搖再倒入瓶子中。電泳液配完會(huì)有泡沫。
1×轉(zhuǎn)膜液：10×轉(zhuǎn)膜液100ml，再加無(wú)水甲醇200ml，加水定容至1L，顛倒混勻15次。量筒用前要清洗，將轉(zhuǎn)膜液倒入瓶子中后，可在量筒中加適量入水搖一搖再倒入瓶子中。轉(zhuǎn)膜液配完不會(huì)有泡沫。
1.2.3. 上樣+電泳
（1）上樣量（10μl），勿忘記上Marker（并且需要在兩端加入marker，方便后續(xù)裁剪膜）。
上樣前可以用移液器吹打上樣孔，防止膠孔堵住，上樣后切勿吹打，可能會(huì)飄樣
（2）電壓：80V，20min，然后調(diào)整電壓至120-130V（時(shí)間需要自己注意，10%分離膠差不多1h。）
1.3. 轉(zhuǎn)膜（轉(zhuǎn)膜液已經(jīng)配好）——提前打好冰，剪好膜。
（1）用刮鏟翹起較薄的玻璃板，在第一個(gè)上樣孔一側(cè)切去一角，然后用刮鏟將膠左右兩側(cè)劃一下，使得膠與板子分離。
（2）準(zhǔn)備好夾子，濾紙，海綿。將其用轉(zhuǎn)膜液浸濕。將剪好的膜放進(jìn)無(wú)水甲醇里激活1min，再放在轉(zhuǎn)膜液中平衡1min。
（3）將黑色面放在下面，一層海綿再加一層濾紙，然后將膠轉(zhuǎn)移到濾紙上（勿產(chǎn)生氣泡），再將平衡好的膜覆蓋在膠上（勿產(chǎn)生氣泡），再將濾紙從一側(cè)輕輕放下，防止產(chǎn)生氣泡，將上下兩塊板對(duì)齊合上放進(jìn)轉(zhuǎn)膜槽里（這樣就不會(huì)錯(cuò)位了）。轉(zhuǎn)膜槽中需要放入冰盒
膜：5.2cm×8.2cm，第一個(gè)上樣孔一側(cè)需要剪掉一小塊標(biāo)記。
（4）冰浴電泳100V，1h（定時(shí)），電流大約在200左右。
1.4. 封閉（1h）
5%脫脂牛奶（40ml，加入2g脫脂奶粉）
1.5. 一抗孵育（4℃搖床過(guò)夜）
用封閉液配制，一般1:1000（也可以使用一抗稀釋液或者1×TBST進(jìn)行配制）
1.6. 1×TBST洗三遍
10min/次，放于搖床。
1.7. 二抗孵育（1-2h）
用封閉液配制，一般1:4000（抗體一般存于-20℃）
1.8. 1×TBST洗三遍
10min/次，放于搖床
1.9. 顯影
顯影儀器提前預(yù)冷。
將膜用鑷子夾出放在藍(lán)色板子上，用紙吸干水分，發(fā)光液1:1混勻，然后將混合液滴在膜上，均勻覆蓋全膜，進(jìn)行拍照。
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