Science | 人工設(shè)計蛋白質(zhì)納米馬達(dá)

原創(chuàng)?huacishu?圖靈基因?2022-05-06 07:03

收錄于合集#前沿生物大數(shù)據(jù)分析

撰文：huacishu

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1、作者通過從頭設(shè)計提供了一個自下而上的平臺來探索納米機(jī)器功能的基本原理和機(jī)制，同時補(bǔ)充了對自然進(jìn)化產(chǎn)生的復(fù)雜分子機(jī)器的長期研究；

2、這些方法可以使一系列用于醫(yī)學(xué)、材料科學(xué)或工業(yè)生物過程的納米設(shè)備工程化。

美國華盛頓大學(xué)D. Baker教授課題組在國際知名期刊Science在線發(fā)表題為“Computational design of mechanically coupled axle-rotor protein assemblies”的論文。天然分子機(jī)器包含蛋白質(zhì)組分，這些蛋白質(zhì)組分彼此相對運動。設(shè)計具有內(nèi)部自由度的納米蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)是計算蛋白質(zhì)設(shè)計的一個突出挑戰(zhàn)。作者發(fā)現(xiàn)軸轉(zhuǎn)子系統(tǒng)在體外和體內(nèi)按照設(shè)計進(jìn)行組裝。使用冷凍電鏡，作者發(fā)現(xiàn)這些系統(tǒng)填充了構(gòu)象可變的相對方向，反映了耦合組件的對稱性和計算設(shè)計的界面能量景觀。這些具有內(nèi)部自由度的機(jī)械系統(tǒng)是設(shè)計基因可編碼納米機(jī)器的一個步驟。

從一個機(jī)器設(shè)計藍(lán)圖開始，該藍(lán)圖由兩個耦合的結(jié)構(gòu)組件組成，類似于軸和轉(zhuǎn)子（圖1A），其中，與天然蛋白質(zhì)旋轉(zhuǎn)系統(tǒng)類似，能量景觀的特征由相互作用組件的對稱性、形狀互補(bǔ)性和跨界面的特定相互作用決定。首先試圖設(shè)計環(huán)狀蛋白質(zhì)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)或轉(zhuǎn)子，其內(nèi)徑大小范圍能夠容納軸狀結(jié)合成分（圖1B）。在第一種方法中，從a-螺旋串聯(lián)重復(fù)蛋白開始，重新設(shè)計它們以形成C1單鏈結(jié)構(gòu)或?qū)ΨQ的C3或C4同源寡聚體。在第二種方法中，從螺旋重復(fù)蛋白（DHR）和螺旋束異二聚體開始，使用基于結(jié)構(gòu)導(dǎo)向剛性螺旋融合的分層設(shè)計程序構(gòu)建C3和C5循環(huán)對稱轉(zhuǎn)子結(jié)構(gòu)。為了便于后續(xù)的顯微鏡表征和模塊化，在轉(zhuǎn)子外側(cè)融合了另一組DHR，產(chǎn)生了臂狀延伸（圖1 A和B）。合成編碼這些轉(zhuǎn)子設(shè)計（12xC3s、12xC4s、2xC5s）的基因，并在大腸桿菌中表達(dá)蛋白質(zhì)。對于C3_R1轉(zhuǎn)子，SAXS數(shù)據(jù)分析與計算模型一致（圖1B）。同樣拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的另一種設(shè)計（C3_R2）也得到了類似的結(jié)果。對于C4設(shè)計C4_1，獲得了與設(shè)計模型密切一致的冷凍電鏡密度圖（圖1B）。使用負(fù)應(yīng)變電鏡對內(nèi)徑較大、拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)不同（C3_R3和C5_2）的C3和C5轉(zhuǎn)子進(jìn)行了表征，得到了與設(shè)計模型一致的低分辨率3D重建（圖1B）。

接下來，試圖設(shè)計高深寬比蛋白質(zhì)組件，使用三種不同的設(shè)計方法，將設(shè)計的轉(zhuǎn)子蛋白質(zhì)穿入其中。在第一種方法中，以參數(shù)化方式生成單螺旋主干，并在D2、D3或D4二面體對稱性中使用埋入氫鍵網(wǎng)絡(luò)和疏水接觸優(yōu)化序列，以產(chǎn)生具有二面體組裝所需的高度特異性的自組裝同源低聚物界面（圖2A）。為了增加總質(zhì)量并使后續(xù)電鏡分析的形狀多樣化，將這些桿狀結(jié)構(gòu)的末端剛性融合到匹配對稱性的環(huán)狀同源低聚物上以構(gòu)建啞鈴狀結(jié)構(gòu)。在第二種方法中，通過使用片段取樣構(gòu)建的剛性螺旋組裝成二面體結(jié)構(gòu)（圖2B）。在第三種方法中，由螺旋發(fā)夾式拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)組成的參數(shù)化生成的同源三聚體骨架被循環(huán)排列和拉長，以生成延伸的C3同源低聚物（圖2C）。獲得了編碼三種方法（12xC3s、12xC5s、12xC8s、6xD2s、12xD3s、6xD4s、6xD5s和12xD8s）產(chǎn)生的軸設(shè)計的合成基因，并在大腸桿菌中表達(dá)了蛋白質(zhì)。設(shè)計的蛋白質(zhì)表達(dá)良好，可溶，易于通過Ni-NTA親和層析純化，并在SEC上進(jìn)一步純化。第一、第二和第三種方法的成功率分別為37.5%（6/16）、43%（14/32）和33%（4/12），這是通過SEC的估計分子量（MW）與設(shè)計模型的MW之間的匹配來評估的（圖2D）。

為了防止由于弱軸-轉(zhuǎn)子相互作用而在低濃度下發(fā)生潛在拆卸作用，作者試圖通過在轉(zhuǎn)子-亞單位界面上安裝二硫鍵，將轉(zhuǎn)子固定在軸周圍。為了逐步控制體外組裝過程，在轉(zhuǎn)子亞單位之間的不對稱界面引入了埋藏的組氨酸介導(dǎo)的氫鍵網(wǎng)絡(luò)，以實現(xiàn)pH控制的轉(zhuǎn)子組裝。為了測試這種方法，選擇了上述三種機(jī)器部件——D3軸、C3轉(zhuǎn)子和C5轉(zhuǎn)子，并構(gòu)建了具有D3-C3和D3-C5對稱性的軸轉(zhuǎn)子組件（分別設(shè)計為D3-C5和D3-C3）（圖3A）。為了將軸和轉(zhuǎn)子連接在一起，對旋轉(zhuǎn)和平移自由度進(jìn)行了計算采樣，并設(shè)計了互補(bǔ)的靜電相互作用表面，不包括軸上的正電荷殘基（賴氨酸和精氨酸）和轉(zhuǎn)子上的負(fù)電荷殘基（天冬氨酸和谷氨酸）。根據(jù)設(shè)計，D3-C3可以沿主對稱軸旋轉(zhuǎn)和平移，而D3-C5轉(zhuǎn)子具有沿x、y和z的旋轉(zhuǎn)和平移組件（圖3、A和B）。獲得編碼單軸和雙轉(zhuǎn)子設(shè)計的合成基因，并在大腸桿菌中分別表達(dá)蛋白質(zhì)，并通過Ni-NTA親和層析和SEC純化。在對設(shè)計的D3軸和C3轉(zhuǎn)子進(jìn)行化學(xué)計量混合后，電鏡分析顯示了組裝和分離的軸和轉(zhuǎn)子分子的集合。在降低pH值并減少二硫化物后，這些顆粒呈現(xiàn)為開放的、線性的、難以區(qū)分的顆粒的混合物。在氧化條件下恢復(fù)pH值后，電鏡顯示顆粒完全組裝。干涉測量分析表明，轉(zhuǎn)子和軸快速關(guān)聯(lián)，關(guān)聯(lián)率約為103?M?1·s?1和微摩爾范圍內(nèi)的離解常數(shù)（Kd）。D3-C5旋轉(zhuǎn)組件也獲得了類似的結(jié)果，在這兩種情況下，SEC和SAXS剖面與設(shè)計模型一致。

其次，試驗了更直接的空間耦合，以限制構(gòu)象變化，主要是轉(zhuǎn)子繞軸旋轉(zhuǎn)。使用形狀互補(bǔ)的軸和轉(zhuǎn)子組件，利用緊密排列的界面和氫鍵網(wǎng)絡(luò)介導(dǎo)的特異性的能力，使限制翻譯的空間結(jié)合起來。使用這種方法設(shè)計了七個軸轉(zhuǎn)子組件：三個帶有C3對稱軸和C1轉(zhuǎn)子，四個更大的設(shè)計帶有C3軸和帶有DHR臂延長件的轉(zhuǎn)子（圖4A）。根據(jù)接口指標(biāo)和設(shè)計規(guī)范，每個接口設(shè)計軌跡產(chǎn)生不同的周期性能量景觀，并形成具有整體齒輪拓?fù)涞男螤罨パa(bǔ)軸轉(zhuǎn)子接口。通過雙順時針表達(dá)轉(zhuǎn)子和軸對，并依靠轉(zhuǎn)子組件上的單個His標(biāo)簽進(jìn)行Ni-NTA凈化，對C3-C1設(shè)計進(jìn)行了裝配試驗篩選。12個設(shè)計中有6個是可溶性表達(dá)和共純化的，這表明這兩個組分組裝在細(xì)胞中，選擇了3個設(shè)計進(jìn)行進(jìn)一步表征。SEC曲線與天然質(zhì)譜相結(jié)合表明，低聚物狀態(tài)與設(shè)計的組裝一致，SAXS數(shù)據(jù)也與設(shè)計模型一致。通過軸和轉(zhuǎn)子的化學(xué)計量混合，對C3-C3設(shè)計（C3-C3_1至C3-C3_4）進(jìn)行體外組裝篩選，然后進(jìn)行SEC和SAXS分析，這與預(yù)期低聚物狀態(tài)的組裝一致。干涉測量顯示，設(shè)計的C3軸和C3轉(zhuǎn)子快速組裝，關(guān)聯(lián)率約為103m?1·s?1和微摩爾范圍內(nèi)的Kd。通過增加軸和轉(zhuǎn)子之間接口的表面積來設(shè)計進(jìn)一步約束的軸-轉(zhuǎn)子組件，以實現(xiàn)更廣泛的能源景觀圖。作者設(shè)計了一個對稱組件，包括一個D8軸，圍繞該軸組裝兩個C4轉(zhuǎn)子（D8-C4），包括一個C5軸和C3轉(zhuǎn)子（C5-C3_1和C5-C3_2），以及一個對應(yīng)于D8-C4（C8-C4）的C8-C4組件（圖4A）。D8-C4組件具有一個軸，用于兩個轉(zhuǎn)子，測試多個耦合旋轉(zhuǎn)自由度在多部件系統(tǒng)中的結(jié)合，還提供了一種通過實驗結(jié)構(gòu)表征監(jiān)測轉(zhuǎn)子相對位置的簡單方法。C4轉(zhuǎn)子具有內(nèi)部C24對稱性，因此對稱性與D8和C8軸匹配。相比之下，C5-C3排列打破了對稱性，由此產(chǎn)生的能量景觀具有15個能量極小值，周期性反映了組成C5和C3的對稱性。通過Ni-NTA純化分離軸和轉(zhuǎn)子，并進(jìn)行化學(xué)計量混合，篩選12個D8-C4、12個C5-C3和6個C8-C4設(shè)計，以進(jìn)行體外組裝。選擇了其中四種設(shè)計進(jìn)行進(jìn)一步的實驗研究，并獲得了指示軸轉(zhuǎn)子復(fù)合體組裝的SEC數(shù)據(jù)，而C5-C3設(shè)計的SAXS分析表明軸轉(zhuǎn)子復(fù)合體組裝。

對每種設(shè)計方法和對稱性類別的一種結(jié)構(gòu)進(jìn)行了冷凍電鏡檢查，并將這些數(shù)據(jù)與基于設(shè)計模型的能量景觀計算相關(guān)聯(lián)（圖3和圖4）。將軸轉(zhuǎn)子組件上的電子密度數(shù)據(jù)與隔離轉(zhuǎn)子和軸上的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，表明它們的剛性方向有相當(dāng)大的變化。對于第一種方法生產(chǎn)的D3-C3和D3-C5組件，獲得的2D類平均值與從設(shè)計模型和3D重建計算出的投影圖非常相似，與總體設(shè)計模型拓?fù)浜驮O(shè)計的異源低聚物狀態(tài)非常一致（圖3 C和D）。對于這兩種設(shè)計，D3軸清晰可見，獲得了與設(shè)計模型幾乎相同的高分辨率軸結(jié)構(gòu)。D3-C3軸轉(zhuǎn)子組件的C1、C3和D3的三維重建在7.8 -分辨率下顯示出與軸中間的轉(zhuǎn)子相對應(yīng)的可見密度，C3轉(zhuǎn)子臂明顯可見（圖3C）。D3-C5設(shè)計的3D重建也顯示了轉(zhuǎn)子的清晰密度，但其分辨率無法進(jìn)一步提高，因為相對于軸的二級結(jié)構(gòu)布局似乎是可變的（圖3D）。對冷凍電鏡?3D重建的檢查還表明，轉(zhuǎn)子臂沿著旋轉(zhuǎn)軸填充了多個位置（圖3 C和D）。通過旋轉(zhuǎn)和平移轉(zhuǎn)子相對于軸產(chǎn)生的能量圖表明，大范圍的方向在能量上是可接近的（圖3B），轉(zhuǎn)子軸剛性方向在分子動力學(xué)（MD）模擬中波動，與D3-C3組件相比，D3-C5組件顯示出更大的位移（圖3B）。沿設(shè)計自由度的構(gòu)象可變性的建模對于生成與實驗2D類平均值非常相似的計算投影是必要的（圖3、C和D）。綜上所述，cryo EM數(shù)據(jù)、Rosetta模型和分子動力學(xué)模擬與軸和轉(zhuǎn)子組件的約束機(jī)械耦合設(shè)計目標(biāo)一致。在第二種方法生成的組件中，C3-C3組件的電鏡分析得出了軸和轉(zhuǎn)子清晰可見的2D級平均值（圖4A）。軸的擴(kuò)散密度和轉(zhuǎn)子的良好分辨率密度之間的對比可能反映了構(gòu)象的變化（圖4 C和D）。軸轉(zhuǎn)子組件主要可以對旋轉(zhuǎn)自由度而非平移自由度進(jìn)行采樣（圖4B），旋轉(zhuǎn)平均增加了設(shè)計模型的預(yù)測與實驗數(shù)據(jù)（圖4 C和D）之間的相似性。綜上所述，數(shù)據(jù)與旋轉(zhuǎn)自由度沿線的可變性一致，符合設(shè)計的能量景觀，該景觀在60°旋轉(zhuǎn)距離處有三個能量最小值（圖4B）。與該景觀中的深度極小值一致，獲得了~5.9-?分辨率的電鏡圖，該圖接近設(shè)計模型（圖4、C和D）。使用cryoSPARC進(jìn)行的3D可變性分析計算表明，轉(zhuǎn)子臂要么對齊，要么偏移，這兩種狀態(tài)幾乎是等概率的，如乙烷的重疊和交錯排列（圖4 D和E）。綜上所述，這些結(jié)果表明，側(cè)鏈相互作用和深度能量極小的顯式設(shè)計降低了純靜電相互作用觀察到的構(gòu)象狀態(tài)的簡并度，并支持能量景觀和觀察到的構(gòu)象可變性之間的對應(yīng)關(guān)系。

軸轉(zhuǎn)子組件的概念驗證表明，現(xiàn)在可以系統(tǒng)地設(shè)計具有內(nèi)部機(jī)械約束的蛋白質(zhì)納米結(jié)構(gòu)。這一進(jìn)展的關(guān)鍵是能夠計算設(shè)計具有復(fù)雜互補(bǔ)形狀、對稱性和拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)組分。對這些形狀互補(bǔ)的同源寡聚體成分組裝成具有內(nèi)部自由度的高階異質(zhì)寡聚體結(jié)構(gòu)的研究，為復(fù)雜蛋白質(zhì)納米機(jī)器的設(shè)計提供了見解。首先，組件之間接口的計算造型可用于促進(jìn)具有選定內(nèi)部自由度的約束系統(tǒng)的自組裝。其次，由此產(chǎn)生的能量景觀的形狀和周期性由成分的對稱性、界面的形狀互補(bǔ)性以及疏水堆積和構(gòu)象混雜的靜電相互作用之間的平衡決定。一般來說，軸和轉(zhuǎn)子之間的界面表面積與對稱的子單元數(shù)量成比例，較大的表面積提供了可用于設(shè)計的較大能量動態(tài)范圍。D3-C3、D3-C5和C3-C3設(shè)計的電鏡數(shù)據(jù)中明顯的構(gòu)象變異性和MD模擬的組合，D8-C4設(shè)計觀察到的離散狀態(tài)表明，這些組件填充了多種旋轉(zhuǎn)狀態(tài)。cryo-EM分析無法區(qū)分構(gòu)象變化是否反映了旋轉(zhuǎn)運動或軸轉(zhuǎn)子組裝期間捕獲的狀態(tài)，并且沒有報告能量屏障高度；需要在單分子水平上的時間分辨顯微鏡來揭示不同狀態(tài)之間的轉(zhuǎn)換動力學(xué)，并將旋轉(zhuǎn)能景觀的計算造型與布朗動力學(xué)聯(lián)系起來。作者的機(jī)械耦合軸轉(zhuǎn)子系統(tǒng)的內(nèi)部周期性但不對稱的旋轉(zhuǎn)能量景觀提供了兩個必需的元素之一。蛋白質(zhì)系統(tǒng)可以通過基因編碼在細(xì)胞內(nèi)或體外進(jìn)行多組分自組裝。綜上所述，這些方法可以使一系列用于醫(yī)學(xué)、材料科學(xué)或工業(yè)生物過程的納米設(shè)備工程化。更重要的是，從頭設(shè)計提供了一個自下而上的平臺，探索納米機(jī)器功能的基本原理和機(jī)制，補(bǔ)充了對自然進(jìn)化產(chǎn)生的復(fù)雜分子機(jī)器的長期研究。

教授介紹

D. Baker教授的研究集中在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)折疊機(jī)制、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用、蛋白質(zhì)-核苷酸相互作用和蛋白質(zhì)-配體相互作用的預(yù)測和設(shè)計上。方法是通過實驗來理解這些問題背后的基本原理，根據(jù)這些見解開發(fā)簡單的計算模型，并通過結(jié)構(gòu)預(yù)測和設(shè)計來測試模型。努力通過在計算和實驗研究不斷改進(jìn)方法。最近的幾個例子說明了D. Baker教授計算預(yù)測和設(shè)計方法的成功應(yīng)用：（i）使用計算蛋白質(zhì)設(shè)計方法創(chuàng)建了一個人工球狀蛋白質(zhì)，新的蛋白質(zhì)可以在原子水平上精確設(shè)計，目前的工作旨在利用這些技術(shù)設(shè)計具有新功能的新蛋白質(zhì)。（ii）重新設(shè)計了蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的特異性，并證明這種特異性變化在體外和體內(nèi)都適用。（iii）從頭計算蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測。在最近的CASP4和CASP5國際蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測方法盲測試中，進(jìn)行了前所未有的精確從頭結(jié)構(gòu)預(yù)測。

參考文獻(xiàn)

Courbet A, Hansen J, Hsia Y, et al. Computational design of mechanicallycoupled axle-rotor protein assemblies. Science. 2022;376(6591):383-390.doi:10.1126/science.abm1183