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一.流程介紹

后續(xù)會開發(fā)lncRNA、smallRNA、circRNA流程
首先是lncRNA流程，主要分析模塊為：

測序數(shù)據(jù)質(zhì)控；
序列比對分析；
轉(zhuǎn)錄本組裝；
lncRNA分析；
表達(dá)量分析；
表達(dá)量差異分析；
lncRNA靶基因分析；
富集分析

1.使用基礎(chǔ)ubuntu鏡像：

docker run -itd --name lnc   ubuntu:18.04

2.安裝json環(huán)境配置環(huán)境
換源：

docker cp sources.list 1a73843e30e5:/etc/apt

apt-get update
apt-get upgrade

lncRNA流程前幾個模塊與有參流程模塊腳本基本一樣，軟件使用相同，直接復(fù)制原來的軟件到lnc環(huán)境中，并安裝即可。

圖片.png

3.測試腳本
01-qc.sh、01-qcStat.sh、02-alignHST.sh、02-alignSummary.sh
使用FastQC質(zhì)控與Hisat2比對;
使用stringtie進(jìn)行轉(zhuǎn)錄本拼接與組裝，分為得到mRNA序列與注釋文件與lncRNA序列與注釋文件
03-assemblyStie.sh腳本：

for sample in $samplenames
do
    delay stringtie
    cd $sample
    mkdir AssemblyStielncRNA
    cd AssemblyStielncRNA

    algn_bam=../AlignmentHST/$sample.bam

    echo "Transcript assembly for $sample at $(date)"

    $stringtie -p $stringtie_threads -G $lnc_gtf \
    -o transcripts.gtf -A $sample.exp -l $sample $algn_bam &

    cd ../

    mkdir AssemblyStieRNA
    cd AssemblyStieRNA

    algn_bam=../AlignmentHST/$sample.bam

    echo "Transcript assembly for $sample at $(date)"

    $stringtie -p $stringtie_threads -G $genome_gtf \
    -o transcripts.gtf -A $sample.exp -l $sample $algn_bam &

    cd ../../

done

根據(jù)lncRNA注釋文件與mRNA注釋文件，拼接得到每個樣本的轉(zhuǎn)錄本注釋文件

mkdir MergedGTFlncRNA_Stie
find */AssemblyStielncRNA/ -name "transcripts.gtf" -type f -printf "%p \n" >transcripts_file-lncRNA.list
$stringtie --merge -p $stringtie_threads -G $lnc_gtf -o MergedGTFlncRNA_Stie/mergedlncRNA.gtf transcripts_file-lncRNA.list
# #$gffcompare -r $genome_gtf -G -o MergedGTFlncRNA_Stie/merged_compare MergedGTFlncRNA_Stie/mergedlncRNA.gtf

 mkdir MergedGTFRNA_Stie
find */AssemblyStieRNA/ -name "transcripts.gtf" -type f -printf "%p \n" >transcripts_file-mRNA.list
$stringtie --merge -p $stringtie_threads -G $genome_gtf -o MergedGTFRNA_Stie/mergedmRNA.gtf transcripts_file-mRNA.list

$cufflinks/gffread -w MergedGTFlncRNA_Stie/transcripts-lncRNA.fa -g $genome_fasta MergedGTFlncRNA_Stie/mergedlncRNA.gtf &

$cufflinks/gffread -w MergedGTFRNA_Stie/transcripts-mRNA.fa -g $genome_fasta MergedGTFRNA_Stie/mergedmRNA.gtf &

分別得到所有樣本lncRNA與mRNA總注釋文件，下一步計算表達(dá)量

for sample in $samplenames
do
    delay stringtie
    cd $sample
    mkdir ExpressionStielncRNA
    cd ExpressionStielncRNA

    algn_bam=../AlignmentHST/$sample.bam 

    echo "Start estimating for $sample at $(date)"

    $stringtie -e -B -p $stringtie_threads -G ../../MergedGTFlncRNA_Stie/mergedlncRNA.gtf \
    -o $sample.gtf -A $sample.exp $algn_bam &

    cd ../

    mkdir ExpressionStieRNA
    cd ExpressionStieRNA

    algn_bam=../AlignmentHST/$sample.bam 

    echo "Start estimating for $sample at $(date)"

    $stringtie -e -B -p $stringtie_threads -G ../../MergedGTFRNA_Stie/mergedmRNA.gtf \
    -o $sample.gtf -A $sample.exp $algn_bam &

    cd ../../

done

得到結(jié)果如下：

圖片.png

4.接下來使用DEseq2或edger進(jìn)行差異分析，可參考有參流程分析：
（1）有生物學(xué)重復(fù)的同時滿足 log2FoldChange 絕對值大于等于 1 且 pvalue 小于 0.05 的基因 significant 標(biāo)為 yes，否則標(biāo)為 no；（2）沒有生物學(xué)重復(fù)的同時滿足 log2FoldChange 絕對值大于等于 1 且 pvalue 小于 1 的基因 significant 標(biāo)為 yes，否則標(biāo)為 no。同時我們會根據(jù)初始運算結(jié)果，對差異閾值做進(jìn)一步定義或者給予建議，例如：1. fold change 閾值更改；2. 統(tǒng)計檢驗閾值（pvalue）更改。滿足顯著性差異閾值的差異基因在分析結(jié)果中通過 significant 參數(shù)一列為 yes 顯現(xiàn)。
5.使用clusterProfiler包進(jìn)行KEGG與GO富集分析；

lncRNA靶基因分析；

10.23更新：

LncRNA預(yù)測分析：
使用軟件：
CNCI；
CPC2；
LGC；

CNCI

CNCI是中科院計算所趙屹團(tuán)隊開發(fā)的一款從轉(zhuǎn)錄組中分析編碼RNA和非編碼RNA的軟件。趙屹團(tuán)隊在非編碼RNA領(lǐng)域做了很多出色的工作，建立了目前最權(quán)威的非編碼RNA數(shù)據(jù)庫NONCODE。
github地址：

https://github.com/www-bioinfo-org/CNCI

安裝：

git clone [git@github.com](mailto:git@github.com):www-bioinfo-org/CNCI.git

cd CNCI

unzip libsvm-3.0.zip

cd libsvm-3.0

make

cd ..

或者下載到服務(wù)器，unzip解壓

基本命令為：

python CNCI_package/CNCI.py -f novel.fasta -o CNCI_out -m ve -p 4
參數(shù)說明：
-f 輸入fasta文件（可以使用-g參數(shù)輸入GTF文件，但是同時需要使用-d參數(shù)指定參考基因組的目錄）
-o 輸出結(jié)果目錄
-m 指定模式，脊椎動物選擇ve，植物選擇pl
-p 指定CPU核數(shù)

更多用法參看幫助文檔
結(jié)果文件：

圖片.png

CPC2

CPC2 下載安裝

https://github.com/gao-lab/CPC2_standalone/releases/tag/v1.0.1

安裝：

gzip -dc CPC2-beta.tar.gz | tar xf -

cd CPC2-beta
export CPC_HOME="$PWD"
cd libs/libsvm
gzip -dc libsvm-3.18.tar.gz | tar xf -
cd libsvm-3.18
make clean && make
cd $CPC_HOME
bin/CPC2.py -i (input_seq) -o (result_in_table)

圖片.png

運行命令：

python3 CPC2.py  -i transcripts-lncRNA.fa

結(jié)果展示：

圖片.png

LGC

LGC是由北京基因組所基于python2 開發(fā)的一款快速lncRNA預(yù)測工具，該工具通過ORF（開放閱讀框）長度和GC含量間的關(guān)系進(jìn)行相關(guān)運算來鑒定lncRNA。LGC最大特點是能夠基于跨物種策略進(jìn)行l(wèi)ncRNA發(fā)掘。因此LGC可以支持有參數(shù)據(jù)和無參數(shù)據(jù) 進(jìn)行l(wèi)ncRNA鑒定。在區(qū)分從植物到哺乳動物的不同物種的lncRNA和蛋白編碼RNA方面，LGC鑒定的準(zhǔn)確率高達(dá)90%。

圖片.png

下載與安裝：

 wget [http://bigd.big.ac.cn/biocode/tools/4/releases/1.0/file/download?filename=lgc-1.0.tar.gz](http://bigd.big.ac.cn/biocode/tools/4/releases/1.0/file/download?filename=lgc-1.0.tar.gz)

tar zxf lgc-1.0.tar.gz

chmod 755 lgc-1.0.py

#確保conda，lgc-1.0.py在環(huán)境變量里

lgc-1.0.py input.fasta output.txt

# Or

python lgc-1.0.py input.fasta output.txt

結(jié)果展示：

圖片.png

二.nextflow使用

圖片.png

這里使用 Nextflow 作為流程搭建工具，它有著很多強大的功能，第一次接觸，首先先安裝：

wget -qO- [https://get.nextflow.io](https://get.nextflow.io/) | bash

或者使用conda安裝

conda install nextflow

官方參考文檔：
https://www.nextflow.io/docs/latest/getstarted.html
這里可以直接使用
直接使用已有l(wèi)ncRNA流程進(jìn)行測試，參考地址
或者使用下面代碼使用rna流程：

nextflow pull nf-core/rnaseq

下載完流程之后：

圖片.png

運行文件為nf結(jié)尾文件，
文件內(nèi)容如下：

#!/usr/bin/env nextflow
import SampleGroup
import Config




/*------------------RNA分析nextflow-pipeline初版-----------------------------

RNA_np_v0.0.1

System： Linux version 3.10.0-693.21.1.el7.x86_64
Tool  ： Nextflow 0.30.2.4867
-------------------------------------------------------------------------*/

/*---------------------------定義基本目錄-----------------------------------

base pathway

database： 與人hg19相關(guān)的數(shù)據(jù)、工具存儲的目錄
opd： output pathway本項目的輸出文件母目錄 
-------------------------------------------------------------------------*/
database="/data/zhangxc/database/homo_sapiens"
opd =  "/data/zhangxc/lnc_rna/lncRNA/output"
main_dir = "/data/zhangxc/lnc_rna/lncRNA"
/*-------------------------讀取樣本及定義組---------------------------------

sample and group

data.ini為樣本和組的配置文件，通過congfig.groovy將定義好的樣本和組讀入pipline中備用

sample = {{sample_name},{sample_file1,sample_file2}}
group = {{group_name},{control_name},{case_name},{control_name,case_name}}

nextflow 同一命名變量只允許一次作為輸入變量
sample 擴展成3份 分別用來進(jìn)行fastqc、SOAPnuke、println 
-------------------------------------------------------------------------*/
params.data_file="/data/zhangxc/lnc_rna/lncRNA/test/data.ini"
config=new Config(params.data_file)
Channel.from( config.ReadSamples() ).set{samples}
samples.into{samples0;samples1;sample_2}
Channel.from( config.ReadGroups() ).set{groups0}
sample_2.println()
/*------------------------------fastqc------------------------------------

fastqc

質(zhì)量控制模塊，獨立于分析流程的單獨模塊
input ： sample
output： otp/fastqc/sample_name
-------------------------------------------------------------------------*/
process fastqc{
    tag { sample_name }
    // container 'biocontainers/fastqc'
    // conda "fastqc"
    publishDir { "output/fastqc/"+ sample_name }
    input:
        set sample_name , files from samples0
    output:
        file "*_fastqc/Images/*.png"
    script:
    if(files.size == 1){
        """
        echo \$PWD
        fastqc --extract -o . ${files[0]}
        """
    }else{
        """
        echo \$PWD
        fastqc --extract -o . ${files[0]} ${files[1]}
        """
    }
}
/*------------------------------soapnuke------------------------------------

soapnuke

質(zhì)量控制模塊，開始與分析第一步，用來去除引物生成clean sample
input ： sample
output： file otp/soapnuke/sample_name/*.fq.gz  val clean_samples-->{{sample_name},{*.fq.gz}}

clean_samples copy to clean_samples1|clean_samples2
-------------------------------------------------------------------------*/
process soapnuke{
    tag { sample_name }
    // container 'registry.cn-hangzhou.aliyuncs.com/bio/soapnuke'
    publishDir path:{"output/soapnuke/"+sample_name} ,mode:'copy',
        saveAs: {filename ->
            if (filename.indexOf(".txt")>0) filename
            else null
        }

    input:
        set sample_name , files from samples1

    output:
        set sample_name , file("*.fq.gz") into clean_samples
        file "*.txt"

    script:
        """
        echo \$PWD
        SOAPnuke filter -1 ${files[0]} -2 ${files[1]} -l 20 -q 0.5  \
            -f GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC -r GATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT \
            -o ./ -C ${sample_name}_1.clean.fq.gz -D ${sample_name}_2.clean.fq.gz
        """
}
clean_samples.into{clean_samples1;clean_samples2;}

/*------------------------------hisat------------------------------------

hisat

比對軟件，與bowtie和tophat功能相似，將read與基因組作比對
input :  clean_samples1
output:  file otp/hisat/sample_name/${sample_name}.sam  val sam-->{{sample_name},{${sample_name}.sam}}
         file otp/hisat/sample_name/*.align_summary.txt val summary_txt-->{{sample_name},{*.align_summary.txt}}
-------------------------------------------------------------------------*/
process hisat{
    tag { sample_name }
    // container 'registry.cn-hangzhou.aliyuncs.com/bio/hisat2'
    publishDir { "output/hisat/"+ sample_name }
    input:
        set sample_name , files from clean_samples1

    output:
        set sample_name , file("${sample_name}.sam") into sam
        set sample_name , file("*.align_summary.txt") into summary_txt

    script:
    """
        echo \$PWD
        hisat2  -x $database/grch37_tran/genome_tran -1 ${files[0]} -2 ${files[1]} -S ${sample_name}.sam 2> ${sample_name}.align_summary.txt
    """
}

/*------------------------------samtools----------------------------------

samtools

工具軟件，將sam轉(zhuǎn)為bam格式，并根據(jù)染色體定位進(jìn)行sort和index
input :  val sam 
output:  file otp/samtools/sample_name/${sample_name}.bam  val sam-->{{sample_name},{${sample_name}.bam}}
-------------------------------------------------------------------------*/
process samtools{
    tag { sample_name }
    // container 'broadinstitute/genomes-in-the-cloud:2.3.1-1512499786'
    publishDir { "output/samtools/"+ sample_name }
    input:
        set sample_name , file('sample.sam') from sam

    output:
        set sample_name , file("${sample_name}.bam") into bam

    script:
    """
        echo \$PWD
        samtools view -bS sample.sam > ${sample_name}_unsorted.bam
        samtools sort -@ 8 ${sample_name}_unsorted.bam ${sample_name}
        samtools index ${sample_name}.bam ${sample_name}.bam.bai
    """
}

/*------------------------------htseq----------------------------------

htseq

轉(zhuǎn)錄組表達(dá)量分析
input :  val bam 
output:  file otp/htseq/sample_name/${sample_name}.rawCount.txt  val htseq_txt-->{{sample_name},{${sample_name}.rawCount.txt}}

htseq_txt copy to htseq_txt0|htseq_txt1|htseq_txt2
-------------------------------------------------------------------------*/
process htseq{
    tag { sample_name }
    //container 'broadinstitute/genomes-in-the-cloud:2.3.1-1512499786'
    //container "dyndna/docker-for-pcawg14-htseq"
    // conda "htseq=0.9.1"
    publishDir { "output/htseq/"+ sample_name }
    input:
        set sample_name , file('bam_files') from bam
    output:
        set sample_name , file("${sample_name}.rawCount.txt") into htseq_txt
    script:
    """
        echo \$PWD
        htseq-count -f bam -m union -s yes -t exon -i gene_id -r pos bam_files \
        $database/Homo_sapiens.GRCh37.75.gtf >${sample_name}.rawCount.txt
    """
}
htseq_txt.into{htseq_txt0;htseq_txt1;htseq_txt2} 

htseq_txt2.println()

/*------------------------------htseq_xls----------------------------------

htseq_xls

轉(zhuǎn)錄組表達(dá)量分析后，將txt文件轉(zhuǎn)換格式為xls
input :  val summary_txt 
         val htseq_txt0
output:  file otp/htseq_xls/sample_name/${sample_name}.rpkm.xls  val htseq_xls-->{{sample_name},{${sample_name}.rpkm.xls}}
-------------------------------------------------------------------------*/
process htseq_xls{
    tag { sample_name }
    //container 'registry.cn-hangzhou.aliyuncs.com/bio/hisat2'
    // container "broadinstitute/genomes-in-the-cloud:2.3.1-1512499786 "
    publishDir { "output/htseq/"+ sample_name }
    input:
        set sample_name , file('txt_files') from summary_txt
        set sample_name , file('sample.rawCount.txt') from htseq_txt0
    output:
        set sample_name , file("${sample_name}.rpkm.xls") into htseq_xls
    script:
    """
        echo \$PWD
        perl /data/zhangxc/lnc_rna/lncRNA/bin/RNAseq_bin/htseq2rpkm_hisat.pl txt_files \
        $database/hg19.GRCh37.74.ncRNA.gene.len \
        sample.rawCount.txt $sample_name ${sample_name}.rpkm.xls
        sed 's/^/$sample_name\t/' ${sample_name}.rpkm.xls | sed '1d' > ${sample_name}.rpkm.tmp
    """
}

只截取到基因表達(dá)量部分，感興趣的可以去嘗試運行，運行方式為：
nextflow run zxc.nf

圖片.png

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Docker封裝生物信息學(xué)lncRNA流程

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一.流程介紹

10.23更新：

CNCI

CPC2

LGC

二.nextflow使用

運行完成，后續(xù)模塊分析中...

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