單細胞技術在 2013 年和 2019 年被 Nature Methods 評選為年度技術，2018 年被 Science 評選為 10 大科學突破。據(jù)統(tǒng)計，CNS 發(fā)表單細胞領域文章已經(jīng)超過 900 篇，其中 2019~2020 期間發(fā)表 285 篇。國自然資助的單細胞項目已經(jīng)達到 513 項，總額 4.1 億，其中 2019 年中標 113 項，總額 6,606 萬。
如果說單細胞技術是熱門，那空間轉錄組就是黑馬，10x Visium 技術一經(jīng)問世，便備受矚目。空間轉錄組避免了組織中細胞位置信息丟失的現(xiàn)象，可以觀測到組織中不同區(qū)域細胞構成和原始基因表達，直接獲取不同功能區(qū)域的差異基因表達信息。
如果說 09~19 年是單細胞技術黃金十年的話，那么接下來 5 年一定是空間轉錄組的天下。
單細胞技術和空間轉錄組二者的結合，可以碰撞出不一樣的火花，既能挖掘出大量前人沒有發(fā)現(xiàn)的信息，也能大幅度提升文章的檔次。
雖然兩者都是現(xiàn)階段的科研寵兒，但是將二者羅列在一起，就一定可以發(fā)表高分文章嗎？
答案是：
NO！
沒有合理的課題設計，
幾十萬的科研經(jīng)費只能是打水漂！
那如何進行課題設計呢？來來來，歐易生物傾囊相授：
構建精細化圖譜，為課題奠定良好的基礎
構建細胞圖譜，是單細胞研究的一大利器。設計單細胞課題時，可以先從細胞圖譜出發(fā)。
構建單細胞圖譜，需要注意，人和小鼠的全組織圖譜已經(jīng)發(fā)表，所以一定要注意圖譜的精細化和差異化。
什么是精細化？
別人發(fā)表了肝臟細胞圖譜，那我們可以構建肝實質(zhì)細胞圖譜。
什么是差異化？
別人發(fā)表了肝癌細胞圖譜，那我們可以構建肝炎的細胞圖譜。
生物體構成的復雜性，遠遠超出人們的認知。單細胞技術是解析這種復雜性的一把利器，細胞圖譜構建的精細化程度越高、差異化程度越大，發(fā)現(xiàn)未知的重大現(xiàn)象的可能性越大。
在現(xiàn)階段，細胞圖譜的精細化和差異化閾值沒有上限。只要你能設計出來并且可以實施，那就放心大膽的去做。
單細胞圖譜挖掘，大有可為
獲得細胞圖譜后，根據(jù) marker 基因，針對感興趣的細胞類型，進行多次亞型劃分，可以判定出前人沒有發(fā)現(xiàn)的細胞亞型。還是上面那句話，生物體構成之復雜，是你我所無法想象的。只要細胞數(shù)足夠大，一定可以找出教科書上沒有提及的細胞種類。
就算捕獲到的細胞數(shù)目不足以支撐發(fā)現(xiàn)稀有細胞，不同樣本類型（sample type）、細胞類型（cell type）或細胞群體（cell cluster）之間的比較，也能提供大量的數(shù)據(jù)供我們深入挖掘。
例如針對感興趣的細胞群體進行擬時序分析挖掘不同細胞群體的分化發(fā)育軌跡，GESA 分析挖掘不同細胞群體的功能和通路，或細胞互作分析不同細胞群體之間的聯(lián)系，都是常用的分析思路。
基于上述發(fā)現(xiàn)之后，再針對關鍵性 marker 基因做一個 FISH 驗證，以 NC 為代表的 10 分文章基本就能拿下。
空間轉錄組聯(lián)合，恰到好處
上面的思路，是單細胞最為常見的分析套路。做到這一步，根據(jù)單細胞層面的數(shù)據(jù)，大家對于所研究的細胞群體會有初步的認識。繼續(xù)朝下深入的話，一般有兩個思路，功能驗證和組學聯(lián)合。
功能驗證的思路，以后有機會可以再深入聊聊。組學聯(lián)合的種類有很多，蛋白層面、表觀層面和免疫層面等等。今天我們主要討論空間層面的組學聯(lián)合。
首先大家需要清楚，為什么要做空間轉錄組？
做完上面提到的單細胞內(nèi)容后，大家對于目標細胞群體應該有了初步的認識，但是仍然會有很多問題值得商榷，例如：
細胞類型鑒定完之后，可能會發(fā)現(xiàn)對照組和處理組的細胞類型差不多，但是表型卻大同小異。同樣類型的細胞，為什么在不同樣本中的表現(xiàn)差異如此之大？基因表達不同的緣故嗎？那又是什么因素導致相同類型的細胞基因表達差異如此之大？
通過降維聚類，特征相似的細胞聚集在一起?；虮磉_相似，便代表這一群細胞行駛的功能是一樣的嗎？既然特征相似，為什么細胞和細胞之間，在二維平面上的分布還是有一定距離？聚類之后的細胞分布，和細胞在組織上的真實分布有什么關系？
細胞的異質(zhì)性是真實存在的，而在單細胞水平下是研究是以群（cluster）為最小單元，這樣分析是否合理？以群為單位，是否會掩蓋或忽略掉細胞之間的關鍵信息？
單細胞水平下分析得到的細胞分化發(fā)育軌跡，或細胞和細胞之間的通訊聯(lián)系，在空間上是否真實分布在臨近區(qū)域？不同細胞之間的聯(lián)系，是直接，還是間接？或者反過來，單細胞水平下分析得到的功能相似的細胞群體，在組織中的分布，一定是在同一區(qū)域嗎？
這些問題，如果僅僅靠單細胞一個層面的數(shù)據(jù)，是很難解釋清的。所以需要在單細胞的基礎上，聯(lián)合空間轉錄組，二者相互印證，才能獲取更真實的信息。
接下來討論一下，如何進行單細胞聯(lián)合空間轉錄組的樣本設計？
目前空間轉錄組價格還是比較貴的，一張 slides 要十幾二十萬。但是一張 slide 有 4 個捕獲區(qū)域，就是可以處理 4 個冷凍切片，這里可以做的文章就大了。
之前單細胞的設計，我們選取了 Control:Case = 3:3 的模式。
如果所研究的病理組織信息可以集中體現(xiàn)在一張切片上，那么一張空間 slides 上放置 Control1+Case3，或者 Control2+Case2 都是可以的。
前者處理組的切片數(shù)為 3，目的是為了更好的分析處理之后不同樣本之間的異質(zhì)性。后者是一種比較穩(wěn)妥的方案，對照組和處理組都設置了重復，可以規(guī)避掉切片質(zhì)量不均導致空間結果不好的風險。
如果需要多張切片才能完整描述所研究的病理組織信息，那就得設置多張空間 slides，甚至需要一張 slides 來描述同一個組織的不同病理區(qū)域。
這個時候，基于經(jīng)費的考慮，可以先選擇一個處理組的樣本做空間轉錄組，拿到有意思的結果之后，可以慢慢補充其他處理組樣本的空間結果。
至于對照組的空間結果是否需要補充，這個后面會提及。
關于單細胞聯(lián)合空間轉錄組的樣本設計，還有一個很重要的點，是否需要對同一個樣本同時進行單細胞和空間？這個問題，必須在一開始就想清楚，否則會導致整個課題的失敗。
我的建議是，如果條件允許，選擇多個組學在同一個樣本上進行，特別是針對人的病理或腫瘤樣本。
所以在樣本準備時候，就要將組織一分為二，一半用來做單細胞，另外一半凍存起來為空間轉錄組做好備份。
小鼠樣本組織通常都比較小，實施起來比較麻煩，可以選擇一只小鼠做單細胞，另取一只小鼠做空間。小鼠模型的背景均一性較好，這樣操作也可以。但是對于腫瘤樣本，建議最好還是在同一個樣本同時進行單細胞和空間轉錄組。
最后，討論一下，如何進行單細胞和空間轉錄組的聯(lián)合分析？
前面說過，通過單細胞轉錄組可以獲取研究對象的細胞圖譜，進而分析得到目標細胞群的 marker 基因、分化軌跡和通訊關系等結果。
上面在討論「為什么要做空間轉錄組？」所提到的幾個問題，都是進行單細胞和空間轉錄組聯(lián)合時可以進行的分析內(nèi)容，此處不再贅述，下面羅列一些新的聯(lián)合分析關注點。
一、通過單細胞細胞類型鑒定結果輔助判定空間轉錄組的細胞類型
空間轉錄組分辨率達不到單細胞水平，10x 目前一個 spot 捕獲 1~10 個細胞，所以如果僅僅通過空間轉錄組的數(shù)據(jù)是無法精確判定每個 spot 的主要細胞類型的。
最近 Nature Biotechnology 上發(fā)表了一個 MIA 算法，可以很好的解決空間數(shù)據(jù)冗雜的現(xiàn)象。
同時，結合空間轉錄組提供的組織水平的 HE 染色信息，也可以對單細胞鑒定到的細胞類型進行修正。
二、通過空間轉錄組快速定位單細胞分析獲得 marker 基因
單細胞數(shù)據(jù)分析可以預測到很多 marker 基因，但是并非所有 marker 基因都能被驗證出來。
一部分原因是由于分析預測的 marker 基因具有假陽性的可能，一部分原因也是由于驗證過程中沒有明確的觀測區(qū)域導致。
單細胞測序獲得的亞型，往往需要復雜的免疫熒光驗證，如果有空間轉錄組的數(shù)據(jù)，也可以快速整合，定位單細胞測序得到的亞群在空間中的位置。
三、 對比不同分組空間結果，深入挖掘單細胞數(shù)據(jù)
前面給大家建議的兩種樣本設計方案里，多張切片的方案中提到先做處理樣本的空間轉錄組，畢竟大家更為關注處理之后組織類型的變化過程。
如果只做了處理樣本的空間轉錄組的話，此時課題設計是以單細胞為主，空間為輔，文章中的討論需要注意主次。
如果經(jīng)費充足的話，建議同時補充對照組的空間轉錄組，對比不同類型樣本之間空間信息的差異，可以深入探討一系列的問題——
a) 空間結構是否具有明確區(qū)域劃分？
b) 不同區(qū)域之間是否有特異性的 marker？
c) 單細胞分化發(fā)育軌跡和空間位置是否有關聯(lián)？
d) 不同區(qū)域的細胞之間是否存在通訊關系？
單細胞和空間轉錄組都屬于當今最前沿的科研技術。很多老師都希望在自己課題中運用這些前沿技術，以此可以快速發(fā)表高分文章。
但是就如上文所言，技術雖好，但正確運用才是關鍵。所以大家一定要在最開始設計好自己的課題思路，否則到最后只能「一場空」。
