相信大家在做PCR反應(yīng)時(shí)總能遇到這樣或是那樣的問題，但多數(shù)都可以歸為兩個(gè)主要問題：
- 基因模板的擴(kuò)增太少（amplification）;
- 非目標(biāo)基因擴(kuò)增太多。
使用添加劑是解決這些問題的常用策略之一。通常添加劑的作用有兩方面：
- 降低基因的二級結(jié)構(gòu)（secondary structure）;
- 降低非特異性的啟動(dòng)（priming）。
今天小編就簡單給大家介紹一下PCR反應(yīng)中常見的添加劑以及它們的作用。
降低二級結(jié)構(gòu)的添加劑
二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）
DMSO可以降低DNA的二級結(jié)構(gòu)，所以通常在擴(kuò)增GC含量很高的基因樣本的時(shí)候都會添加。但是，DMSO 也會大大降低Taq 聚合酶（Taq polymerase）的活性（activity）。所以，大家要權(quán)衡好模板的接近率（template accessibility）和聚合酶的活性。小編建議大家可以嘗試不同的DSMO的濃度，例如從2% 到10%，來找出適合自己實(shí)驗(yàn)的濃度。
非離子性洗滌劑（Non-ionic detergents）
非離子性洗滌劑，例如0.1-1% 的Triton X-100, Tween 20 或是NP-40，通?？梢越档虳NA二級結(jié)構(gòu)。雖然這樣可以增加模板基因的擴(kuò)增，但也會帶來非特異性擴(kuò)增的困擾。所以，這些添加劑對無雜物低產(chǎn)量的PCR反應(yīng)很管用，但對相對不太純的PRC反應(yīng)就沒那么好了。非離子性洗滌劑的另外一個(gè)好處就是可以減少SDS 污染。通常在DNA提取過程中，SDS會被帶到PCR這個(gè)步驟，這就大大抑制了聚合酶的活性。所以，反應(yīng)中加入0.5% 的Tween-20 或是Tween -40 可以中和SDS帶來的負(fù)面影響。
甜菜堿（Betaine）
甜菜堿可以通過減小二級結(jié)構(gòu)的形成來提高DNA的擴(kuò)增，并且一般是商用PCR kit的“神秘”添加物。如果大家要用甜菜堿的話，應(yīng)該放甜菜堿或是一水甜菜堿（Betaine or Betaine mono-hydrate），但不是鹽酸甜菜堿（Betaine HCl）, 調(diào)成最終濃度為1-1.7M 的濃度。甜菜堿還可以幫助提高特異性，因?yàn)樗芟鼶NA融化/變性時(shí)對堿基對的依賴（eliminate the base pair composition dependence of DNA melting/DNA denaturation） 。
降低非特異性啟動(dòng)的添加劑
甲酰胺（Formamide）
甲酰胺是一種常用的有機(jī)PCR添加劑。它可以和DNA中的大溝（major groove）和小溝（minor groove）相結(jié)合，從而降低母版DNA雙螺旋的穩(wěn)定性并且減低DNA的解鏈溫度（melting temperature）。甲酰胺在PCR實(shí)驗(yàn)中使用的濃度通常在1%-5%。
四甲基氯化銨（Tetramethyl ammonium chloride，TMAC）
四甲基氯化銨可以增加雜化的特異性（hybridization specificity）并且提高DNA的解鏈溫度。因此，TMAC 可以去除非特異性的啟動(dòng)，并且減少DNA和RNA的錯(cuò)誤結(jié)合。如果大家在PCR反應(yīng)中使用簡并引物（degenerate primers）時(shí)，記得可以添加TMAC，它常用的使用濃度為15-100mM。
其他常見的添加劑
除了以上提到的兩大類添加劑，PCR反應(yīng)中還有許多常見的添加劑，雖然作用不同，但也至關(guān)重要。
鎂離子（Magnesium ion）
鎂離子是聚合酶不可缺少的一個(gè)輔因子（cofactor），也就是說如果沒有鎂離子的話，聚合酶是沒有活性的。但是，過多的鎂離子同樣也會影響聚合酶的工作效率。每種PCR反應(yīng)中鎂離子的濃度都不盡相同。螯合劑（Chelating agents，例如EDTA 或是 citrate）, dNTP 的濃度和蛋白質(zhì)都會影響鎂離子的濃度。所以，如果你的PCR實(shí)驗(yàn)有問題，可以嘗試改變不同的鎂離子濃度，例如從1.0到4.0mM，中間間隔 0.5–1mM 就可以。
值得注意的是，多次凍融循環(huán)能夠?qū)е侣然V溶液（magnesium chloride）的濃度分層。所以大家在每次使用之前一定要完全溶解，并且混合均勻之后再使用。
牛血清白蛋白（Bovine albumin，BSA）
在分子化學(xué)實(shí)驗(yàn)中，牛血清白蛋白是很常見的添加劑，尤其在限制酶酶切和PCR的實(shí)驗(yàn)中。在PCR反應(yīng)中，BSA 對于減少污染物，例如酚類化合物（phenolic compounds）有一定幫助。而且也有說法是它能減少反應(yīng)物附著在試管壁的情況。在PCR反應(yīng)中，通常BSA添加的濃度可達(dá)到0.8 mg/ml。
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