近日，英國弗朗西斯·克里克研究所（Francis?Crick?Institute）James M A Turner團(tuán)隊深入探討了有袋類動物（Marsupial，以負(fù)鼠Monodelphis domestica為模型）和真獸類（eutherian，即胎盤類哺乳動物）胚胎發(fā)育過程中DNA甲基化的動態(tài)變化。研究通過繪制負(fù)鼠的精子、卵子、胚胎和成年組織的單堿基分辨率DNA甲基化圖譜，揭示了有袋類動物與真獸類在胚胎發(fā)育過程中DNA甲基化模式的顯著差異。相關(guān)研究成果以《Divergent DNA methylation dynamics in marsupial and eutherian embryos》為題發(fā)表于《自然》（Nature）雜志。

標(biāo)題：Divergent DNA methylation dynamics in marsupial and eutherian embryos（有袋類和真獸類動物胚胎中DNA甲基化動態(tài)差異）

發(fā)表時間：2025-05-14

發(fā)表期刊：Nature

影響因子：IF48.5/Q1

技術(shù)平臺：微量WGBS、單細(xì)胞甲基化+單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)等

本研究在有袋類動物負(fù)鼠（Monodelphis domestica）的精子、卵子、胚胎和成年組織中繪制生成了單堿基分辨率的DNA甲基化圖譜，揭示了與真獸類模型的DNA甲基化動態(tài)差異變化。負(fù)鼠卵子和精子之間的DNA甲基化水平差異小于真獸類。此外與真獸類不同，負(fù)鼠基因組在卵裂階段保持高甲基化狀態(tài)。在囊胚中，上胚層（epiblast, EPI, 未來軀體）的DNA去甲基化短暫且溫和，而滋養(yǎng)外胚層（trophectoderm, TE, 未來胎盤）的DNA去甲基化則表現(xiàn)出持續(xù)狀態(tài)，這表明DNA低甲基化在哺乳動物胎盤中可能具有進(jìn)化上保守的功能。同時，負(fù)鼠在胚胎發(fā)育過程中，非活性X染色體整體上呈現(xiàn)出DNA低甲基化狀態(tài)。研究鑒定出精子和卵子中的差異甲基化區(qū)域（DMRs），這些區(qū)域在胚胎中表現(xiàn)出不同的命運(yùn)，其中一些是短暫的，而另一些則被保留下來，成為候選的印記位點。研究還揭示了通過母本對類似Xist的非編碼RNA RSX（一種與X染色體失活相關(guān)的非編碼RNA）的DNA甲基化來實現(xiàn)印記X染色體失活的可能機(jī)制。總之研究闡明了進(jìn)化上分化的真獸類和有袋類動物在胚胎發(fā)育過程中的DNA去甲基化方式存在差異。

易小結(jié)

DNA甲基化作為一種關(guān)鍵的表觀遺傳修飾，在哺乳動物胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。它參與調(diào)控基因表達(dá)、細(xì)胞分化以及維持基因組穩(wěn)定性。在早期胚胎發(fā)育階段，DNA甲基化模式會發(fā)生顯著的動態(tài)變化，這些變化對于細(xì)胞命運(yùn)的決定和胚胎的正常發(fā)育至關(guān)重要。前期參與的合作項目已助力揭示人多能干細(xì)胞向胚胎全能8細(xì)胞的人工誘導(dǎo)、成功構(gòu)建胚胎干細(xì)胞嵌合體猴。

本研究通過同樣的微量DNA甲基化測序研究揭示了有袋類動物和真獸類在胚胎發(fā)育過程中DNA甲基化模式的差異，這對于理解哺乳動物胚胎發(fā)育的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制具有重要意義。這項研究借助表觀基因組學(xué)的比較分析，為闡釋哺乳動物演化歷程中的表觀遺傳分化提供了至關(guān)重要的依據(jù)，同時也為構(gòu)建跨物種胚胎操作技術(shù)體系、守護(hù)瀕危有袋動物物種構(gòu)筑了堅實的理論支撐。微量WGBS技術(shù)的應(yīng)用不僅為研究哺乳動物胚胎發(fā)育的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制提供了新的工具，也為今后類似的研究提供了重要的參考。

研究方法

樣本收集：研究者收集了負(fù)鼠的精子、卵子以及從胚胎第1.5天到第7.5天的胚胎樣本，以及成年組織樣本（代表三個胚層）。

DNA甲基化圖譜繪制：使用微量WGBS技術(shù)對微量負(fù)鼠精子、卵母細(xì)胞、單個胚胎（包括囊胚階段的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)外胚層）及成體組織進(jìn)行單堿基分辨率檢測全基因組甲基化，覆蓋4.2%-83%的CpG位點。

免疫熒光染色：對5-甲基胞嘧啶（5mC）和5-羥甲基胞嘧啶（5hmC）進(jìn)行免疫染色，以觀察DNA甲基化狀態(tài)。

單細(xì)胞多組學(xué)分析：在囊胚階段分離內(nèi)細(xì)胞團(tuán)（含上胚層和原始內(nèi)胚層）與滋養(yǎng)外胚層，對胚胎進(jìn)行單細(xì)胞多組學(xué)（單細(xì)胞甲基化組和轉(zhuǎn)錄組）分析，以觀察不同細(xì)胞系中的DNA甲基化變化。

CRISPR基因編輯：通過CRISPR技術(shù)敲除DNMT1基因，在負(fù)鼠成纖維細(xì)胞中研究DNA甲基化對X染色體失活相關(guān)非編碼RNA（RSX）的調(diào)控機(jī)制。

結(jié)果圖形

（1）負(fù)鼠卵裂胚胎保持高甲基化

有袋類動物擁有核心的脊椎動物DNA甲基化機(jī)制，包括從頭甲基轉(zhuǎn)移酶基因（DNMT3A和DNMT3B）、DNMT3L、TET1-3、UHRF1以及兩個維持甲基轉(zhuǎn)移酶基因（DNMT1A和DNMT1B）。然而，精子和卵子以及植入前發(fā)育過程中的DNA甲基化狀態(tài)尚未被研究。

研究通過微量重亞硫酸鹽測序（low-input BS-seq）技術(shù)，發(fā)現(xiàn)負(fù)鼠胚胎在早期發(fā)育過程中沒有經(jīng)歷整體DNA去甲基化，這與真獸類胚胎發(fā)育過程中的經(jīng)典模式不同。這種高甲基化狀態(tài)一直持續(xù)到胚胎第4.5天，隨后在囊胚階段，DNA甲基化水平開始下降。研究結(jié)果表明，與真獸類不同，負(fù)鼠胚胎在卵裂階段保持相對高甲基化狀態(tài)。

圖1：負(fù)鼠胚胎中的DNA甲基化水平動態(tài)變化a. 顯微鏡下觀察到的精子、E1.5-E7.5的負(fù)鼠胚胎和大腦的圖像。ED代表胚胎盤，TE代表滋養(yǎng)外胚層。b. 直方圖顯示在≥5×覆蓋度下捕獲的CpG位點的DNA甲基化分布。c. 隨著發(fā)育時間點變化的平均DNA甲基化水平。d. 顯微照片：受精后29.5小時的原核期胚胎，分別對組蛋白H3（n=7）、5-甲基胞嘧啶（5mC，n=8）、5-羥甲基胞嘧啶（5hmC，n=3）進(jìn)行免疫染色，并與H3K9三甲基化（H3K9me3）共染色。兩個原核（Pat代表父本，Mat代表母本）大小相當(dāng)（與小鼠不同），但父本原核通常因靠近精子尾部而被標(biāo)記（第一張圖中的箭頭）。

（2）上胚層（EPI）和滋養(yǎng)外胚層（TE）的DNA甲基化差異

研究通過單細(xì)胞多組學(xué)技術(shù)，結(jié)合單細(xì)胞甲基組和轉(zhuǎn)錄組分析，揭示了不同細(xì)胞譜系的甲基化差異。研究結(jié)果表明，在負(fù)鼠胚胎中，滋養(yǎng)外胚層和上胚層的DNA甲基化水平存在顯著差異。滋養(yǎng)外胚層的DNA去甲基化表現(xiàn)出持續(xù)狀態(tài)，而上胚層的DNA去甲基化短暫且溫和。由于負(fù)鼠囊胚是單層，因此這種差異可能通過細(xì)胞自主機(jī)制實現(xiàn)。

圖2：負(fù)鼠滋養(yǎng)外胚層和上胚層的差異甲基化a. 囊胚單細(xì)胞在譜系分離前后平均甲基化水平。E5.5的細(xì)胞數(shù)為58，E6.5上胚層（EPI）的細(xì)胞數(shù)為19，E6.5滋養(yǎng)外胚層（TE）的細(xì)胞數(shù)為19，E7.5上胚層的細(xì)胞數(shù)為24，E7.5滋養(yǎng)外胚層的細(xì)胞數(shù)為14。b. 根據(jù)胚胎盤（ED）和滋養(yǎng)外胚層（TE）的甲基化模式，將基因組劃分為具有相似甲基化水平的連續(xù)區(qū)域（1-3段）。滋養(yǎng)外胚層中存在具有中等甲基化水平的長段表明該組織存在部分甲基化區(qū)域。c. 基于先前RNA-seq測序數(shù)據(jù)得出的DNA甲基化機(jī)制的平均表達(dá)水平。各組樣本量分別為：卵子6個，E1.5胚胎7個，E2.5胚胎21個，E3.5胚胎62個，E4.5胚胎55個，E5.5胚胎140個，E6.5胚胎201個，E7.5上胚層108個，E7.5滋養(yǎng)外胚層55個。

（3）配子（精子和卵子）的DNA甲基化圖譜

研究基于微量WGBS技術(shù)在單堿基分辨率下檢測精子和卵子的全基因組甲基化狀態(tài)，分析結(jié)果表明，在負(fù)鼠的精子和卵子中發(fā)現(xiàn)了差異甲基化區(qū)域（DMRs），這些區(qū)域在胚胎發(fā)育過程中表現(xiàn)出不同的命運(yùn)。一些DMRs是短暫的，而另一些則被保留下來，成為候選的印記位點。這些發(fā)現(xiàn)為研究哺乳動物胚胎發(fā)育中的印記基因提供了新的線索。

圖3：精子和卵子中的DNA甲基化a. 精子和卵子中差異甲基化區(qū)域（DMRs）的基因組分布情況。b. 精子和卵子中的DMRs在胚胎發(fā)育過程中的命運(yùn)。c. 在印記基因NKRFL2位點的一個代表性區(qū)域，各個CpG位點的DNA甲基化水平。d. 在真獸類和有袋類動物負(fù)鼠卵子中，卵子中被轉(zhuǎn)錄基因（活躍）、卵子中未被轉(zhuǎn)錄基因（不活躍）以及基因間區(qū)域的DNA甲基化特征。圖表中間的線表示中位數(shù)，灰色圓圈表示平均值，上下界分別表示第一和第三四分位數(shù)，須表示1.5倍的四分位距（IQR）。

（4）非活性X染色體的低甲基化

基于微量WGBS技術(shù)在單堿基分辨率下檢測非活性X染色體（Xi）的甲基化狀態(tài)，分析結(jié)果揭示了在負(fù)鼠中，非活性X染色體（Xi）在胚胎發(fā)育過程中逐漸變得低甲基化，這與真獸類中Xi的高甲基化狀態(tài)不同。研究結(jié)果表明，Xi的低甲基化狀態(tài)在囊胚階段開始顯現(xiàn)，并在胚胎發(fā)育過程中逐漸增強(qiáng)。

圖4：負(fù)鼠X染色體和RSX位點的DNA甲基化狀態(tài)a. 成年雄性和雌性大腦中常染色體和X染色體的甲基化分布，以密度圖表示數(shù)據(jù)的分布情況以及一個變量具有特定值的概率。b. 雄性和雌性配子以及胚胎中常染色體和X染色體的甲基化分布。c. 配子、胚胎和成年組織中RSX位點的甲基化情況。d. DNMT1基因敲除（KO）永生化雄性成纖維細(xì)胞中的定量PCR分析。對照組樣本數(shù)為3，DNMT1敲除組樣本數(shù)為3。e. 野生型和DNMT1-KO第8天永生化雄性成纖維細(xì)胞中的RSX RNA熒光原位雜交。f. DNMT1基因敲除（KO）后4天和8天，RSX位點在RNA熒光原位雜交中的量化。g. DNMT1基因敲除（KO）后4天和8天，X染色體與常染色體（X/A）基因表達(dá)比值。對照組樣本數(shù)為3，DNMT1敲除組樣本數(shù)為3。h. 真獸類動物（左側(cè)）和負(fù)鼠（右側(cè)）胚胎中DNA甲基化狀態(tài)的示意圖。

5) 印記X染色體失活的候選機(jī)制

研究通過基因編輯技術(shù)（CRISPR）和微量WGBS技術(shù)相結(jié)合，在基因水平上探究DNA甲基化對RSX表達(dá)的調(diào)控作用。研究提出了一個可能的機(jī)制，即通過母本DNA甲基化調(diào)控RSX表達(dá)，來實現(xiàn)印記X染色體失活。通過CRISPR介導(dǎo)的DNMT1基因敲除，研究者發(fā)現(xiàn)DNA甲基化對RSX表達(dá)具有調(diào)控作用，這為理解有袋類動物中印記X染色體失活的機(jī)制提供了新的線索。

圖5：負(fù)鼠永生化雄性成纖維細(xì)胞中DNMT1缺失。a. 100000個隨機(jī)選取的1000核苷酸區(qū)域的meta分析圖，顯示在DNMT1缺失的成纖維細(xì)胞中，第4天時DNA甲基化水平整體下降。b. 在DNMT1缺失后第4天，RSX啟動子處DNA甲基化鑲嵌性丟失。c. 在DNMT1缺失的成纖維細(xì)胞中，第8天時按染色體劃分的上調(diào)和下調(diào)基因的比例。d. DNMT1缺失后重復(fù)元件的甲基化和表達(dá)情況。meta分析（上）顯示在DNMT1缺失后4天，L1、MIR和ERV1重復(fù)元件的DNA甲基化水平下降。線圖（下）顯示在DNMT1缺失后第8天，L1、MIR、ERV1和ERVK元件的轉(zhuǎn)錄去抑制情況。e. 在DNMT1缺失的成纖維細(xì)胞中，H19的qPCR分析。

討論和啟示

本研究利用微量WGBS測序（low-input?BS-seq）、單細(xì)胞多組學(xué)技術(shù)和基因編輯技術(shù)等三大核心技術(shù)體系，深入研究了有袋類動物和真獸類胚胎發(fā)育過程中DNA甲基化的動態(tài)變化和模式差異，提出了DNA去甲基化在滋養(yǎng)外胚層形成中的重要作用。研究還提出了一個新的候選機(jī)制，即通過母本DNA甲基化調(diào)控RSX表達(dá)來實現(xiàn)印記X染色體失活。

這一發(fā)現(xiàn)不僅增進(jìn)了對有袋類動物胚胎發(fā)育過程中DNA甲基化動態(tài)的理解，還為研究哺乳動物胚胎發(fā)育的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制提供了新的視角。此外，研究還發(fā)現(xiàn)了新的候選印記基因，這些基因在有袋類動物和真獸類中可能具有不同的調(diào)控機(jī)制。本研究為哺乳動物胚胎發(fā)育的進(jìn)化研究提供了新的線索，并可能對生殖醫(yī)學(xué)、發(fā)育生物學(xué)以及相關(guān)疾病的治療提供重要的理論基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

LeekeBJ, Varsally W, Ogushi S, Zohren J, Menchero S, Courtois A, Snell DM,Teissandier A, Ojarikre O, Mahadevaiah SK, Decarpentrie F, Oakey RJ, VandeBergJL, Turner JMA. Divergent DNA methylation dynamics in marsupial and eutherianembryos. Nature. 2025 May 14. doi: 10.1038/s41586-025-08992-2.