莎莎寫(xiě)于2020.5.13? 昨天寫(xiě)RNAi學(xué)習(xí)手冊(cè)寫(xiě)到一半太困了然年上床睡覺(jué)也沒(méi)睡著，一直在為實(shí)驗(yàn)的事情發(fā)愁。然后剛好小伙伴問(wèn)我要不要去實(shí)驗(yàn)室，然后我們就一起去了細(xì)胞培養(yǎng)室做了細(xì)胞凍存，但是我現(xiàn)在沒(méi)有自己的細(xì)胞，所以我就要想辦法找?guī)熃阋恢旮伟┘?xì)胞，然后要到之前先學(xué)習(xí)一下肝癌細(xì)胞是如何培養(yǎng)的吧。
1.實(shí)驗(yàn)室常用肝癌細(xì)胞株
1、 SMMC-7721人肝癌細(xì)胞株
SMMC-7721細(xì)胞系是于1977年建立，材料取自一名50歲男性原發(fā)性肝細(xì)胞癌HCC患者的手術(shù)切除標(biāo)本進(jìn)行體外培養(yǎng)而得。其生物學(xué)特性如下: 細(xì)胞系生長(zhǎng)較迅速穩(wěn)定，在原代細(xì)胞開(kāi)始傳代階段增殖緩慢，以后趨于穩(wěn)定而迅速生長(zhǎng)；細(xì)胞形態(tài)為上皮樣；貼壁生長(zhǎng)；細(xì)胞的亞微結(jié)構(gòu)形態(tài)符合癌細(xì)胞的一般特征；甲胎蛋白(α-fetoprotein, AFP)免疫熒光染色呈陽(yáng)性；LDH同工酶譜的變化與肝癌細(xì)胞的一般特征一致；免疫缺陷小鼠體內(nèi)可成瘤率高，動(dòng)物異種后瘤結(jié)節(jié)經(jīng)病理切片檢查，其組織形態(tài)和原手術(shù)切除標(biāo)本類(lèi)似。
2、Bel-7402人肝癌細(xì)胞株
Bel-7402于1974年建立，來(lái)源于一位53歲男性肝癌患者的手術(shù)切除標(biāo)本，屬于HCC。生物學(xué)特性如下: 細(xì)胞增長(zhǎng)迅速而恒定，6-7 d可傳代1次；細(xì)胞形態(tài)以多邊形上皮樣占絕大多數(shù)；貼壁生長(zhǎng)；細(xì)胞染色體中有一大而長(zhǎng)的近端著絲點(diǎn)染色體，出現(xiàn)頻率高，是本株細(xì)胞的標(biāo)記染色體；AFP免疫熒光反應(yīng)陽(yáng)性；LDH、G6PD、TAT等酶代謝及細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)基本上保持臨床人體肝癌的特性；異種接種后成瘤率高，3-4d可成瘤，瘤塊組織學(xué)病理與臨床HCC相近。
3、 MHCC97人肝癌細(xì)胞株
該細(xì)胞系由上海醫(yī)科大學(xué)中山醫(yī)院建立, 將一名我國(guó)39歲男性HCC患者的肝右葉轉(zhuǎn)移病灶的手術(shù)切除標(biāo)本接種于裸鼠肝內(nèi)建造出人肝癌裸鼠轉(zhuǎn)移模型(LCI-D20)而得。已證實(shí), 經(jīng)過(guò)再次分離得到的MHCC97H、MHCC97L及HCCLM33種細(xì)胞株，依據(jù)它們的轉(zhuǎn)移特點(diǎn)，雖來(lái)源同一父系，但具有異質(zhì)性，即具有不同的轉(zhuǎn)移潛能。
MHCC97人肝癌細(xì)胞系于1998年從裸鼠人肝癌轉(zhuǎn)移模型(LCI-D20)體外傳代培養(yǎng)獲得，該細(xì)胞系符合一般人惡性腫瘤的病理學(xué)和遺傳學(xué)特征，細(xì)胞呈上皮樣，貼壁生長(zhǎng)，血清HBsAg、AFP高表達(dá)，成瘤率高且優(yōu)先轉(zhuǎn)移的靶器官是肺，肺轉(zhuǎn)移率100%，故證實(shí)該細(xì)胞系為高轉(zhuǎn)移特性的人肝癌細(xì)胞系。
2001年，研究者從MHCC97細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)并分離出不同轉(zhuǎn)移潛能的2個(gè)細(xì)胞系MHCC97-H和MHCC97-L，前者肺轉(zhuǎn)移率100%，后者40%；從生長(zhǎng)速度上，前者細(xì)胞倍增時(shí)間較后者短；穿透人工基底膜能力前者較后者大；前者均較后者活力強(qiáng)、代謝旺。傳代至20代后，兩種形態(tài)學(xué)特征及生長(zhǎng)速度方面均較穩(wěn)定。之后又從MHCC97-H裸鼠接種后成功得到更高轉(zhuǎn)移潛能的HCCLM3細(xì)胞系。
4、HepG2人肝母細(xì)胞瘤
1979年，從阿根廷一名15歲高加索男孩的原發(fā)性肝胚細(xì)胞瘤中分離出并建立, 該細(xì)胞系呈上皮樣; 貼壁抱團(tuán)生長(zhǎng); 生長(zhǎng)較快, 傳代周期為1-2d; 低轉(zhuǎn)移; 裸鼠中成瘤率較差;AFP陽(yáng)性; HBsAg陰性, 然而目前尚未證明該細(xì)胞中有乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)基因組; 但通過(guò)實(shí)驗(yàn)已證實(shí), 該細(xì)胞系分化程度較高, 細(xì)胞里代謝酶的生物轉(zhuǎn)化特性較完整, 不需加入外源性活化系統(tǒng)。在藥物作用相關(guān)研究中代謝酶保持穩(wěn)定, 不會(huì)因傳代次數(shù)增多而有所改變, 所含有的生物轉(zhuǎn)化代謝酶與人正常肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞同源, 因此, 常被用于體外肝細(xì)胞代謝或遺傳毒性試驗(yàn)方面的理想細(xì)胞系. 其中, HepG2.2.15是目前應(yīng)用較為廣泛的細(xì)胞株, 它是HepG2的衍生物是體外篩選抗HBV藥物的良好模型, 并用于抗HBV新藥開(kāi)發(fā)的體外研究工具。
5、Hep3B人肝癌細(xì)胞株
Hep3B分離自8歲美國(guó)黑人男童的肝癌組織. 細(xì)胞形態(tài)跟HepG2類(lèi)似, 呈上皮細(xì)胞, 電鏡下觀察胞漿里面很多粗大的黑顆粒, 同樣喜抱團(tuán)貼壁生長(zhǎng); 其在裸鼠中能致瘤, 但基本不轉(zhuǎn)移. HBV陽(yáng)性, 這與HepG2不同, 這株細(xì)胞整合了完整的HBV基因組，可用于HBV感染后發(fā)展致癌相關(guān)研究。
6、 Huh-7人肝癌細(xì)胞株
該細(xì)胞系于1982年從一名患有肝癌的57歲日本男性肝癌組織標(biāo)本上培養(yǎng)而得。該細(xì)胞AFP陽(yáng)性，高度分化, 細(xì)胞呈上皮樣, 貼壁生長(zhǎng). 特點(diǎn)是HBV陰性, 而具有丙型肝炎病毒(hepatitisC virus, HCV)易感性，故可用于HCV與肝癌的關(guān)系的研究. 除了用于研究致癌性, 還用于基因表達(dá)的調(diào)節(jié)機(jī)制、新陳代謝及VLDL的分泌等. 此細(xì)胞系的特別之處如下: 可用于生產(chǎn)重組蛋白如促紅細(xì)胞生成素; 在蛋白質(zhì)生物學(xué)方面用于研究在肝細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的登革病毒; 廣泛用于異種移植動(dòng)物模型.
7、 PLC/PRF/5人肝癌亞歷山大細(xì)胞
PLC/PRF/5人肝癌亞歷山大細(xì)胞于1976年建系, 細(xì)胞來(lái)自一位患有原發(fā)性HCC的莫桑比克男性患者的標(biāo)本; 為上皮樣貼壁生長(zhǎng); AFP陽(yáng)性, 不產(chǎn)生白蛋白; 分泌ad亞型的HBsAg而不產(chǎn)生HBcAg或HBeAg和Dane顆粒, 卻可維持HAV的繁殖; 該細(xì)胞可能含有全部HBV基因組, 同工酶譜及核型與人類(lèi)同源;裸鼠異種移植可致瘤. 此細(xì)胞系因其產(chǎn)生HBsAg的物理化學(xué)和免疫化學(xué)特性跟HBV攜帶者血清中HBsAg相似, 因此, 可被用來(lái)研究HBV體外病毒及其與原發(fā)性肝癌的關(guān)聯(lián), 抗HBV疫苗所需的HBsAg顆粒的制備及抗病毒藥物的制備等方面。
人肝癌細(xì)胞系具有以下優(yōu)點(diǎn)：
首先，在選擇實(shí)驗(yàn)對(duì)象的比較上，人肝癌細(xì)胞系相較于人原代肝細(xì)胞，克服了人原代肝細(xì)胞來(lái)源困難、實(shí)驗(yàn)難控制、存活時(shí)間短的局限，肝癌細(xì)胞系為已獲得的穩(wěn)定傳代的細(xì)胞，具有來(lái)源方便、操作簡(jiǎn)單、條件可控和可重復(fù)等優(yōu)點(diǎn)，是用于肝癌疾病相關(guān)研究的理想對(duì)象。
其次，肝癌細(xì)胞系均選擇來(lái)源于確診肝癌患者的病理組織，具有與肝癌患者體內(nèi)相似的遺傳基因組，其發(fā)生發(fā)展機(jī)制、功能蛋白表達(dá)、病毒復(fù)制能力、侵襲轉(zhuǎn)移功能及抗藥性等，具有與人類(lèi)親源體極其相近的特點(diǎn)，因此更適合應(yīng)用于肝癌各領(lǐng)域的研究.
2.以HepG2/SMMC-7721為例做主要介紹：
3.BEL7402/hepG2/HCCLM等肝癌細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程
4.HepG2細(xì)胞培養(yǎng)的條件
HepG2人肝腫瘤細(xì)胞株廣泛應(yīng)用于遺傳毒理學(xué)及病毒培養(yǎng)等方面的研究,研究肝臟疾病發(fā)病機(jī)理及其臨床應(yīng)用有著重要意義。由于其與肝細(xì)胞具有相同的生物學(xué)活性，還被用于胰島素抵抗的研究。本文對(duì)肝癌細(xì)胞培養(yǎng)的最佳條件做一簡(jiǎn)單綜述。
1.HepG2細(xì)胞的復(fù)蘇條件
1.1 復(fù)蘇溫度的選擇
唐孟萱等采用下述方法進(jìn)行細(xì)胞復(fù)蘇：快速將所凍存細(xì)胞40℃水浴搖床60轉(zhuǎn)/ min慢搖至其溶解，溶解后馬上轉(zhuǎn)入 37 ℃水浴箱，手工慢搖恒溫 2～3min復(fù)蘇 ,復(fù)蘇后 800 轉(zhuǎn)/ min 離心 5min,吸去上清加入 10ml 含 15%胎牛血清 DMEM 培養(yǎng)基 ,混勻后加入細(xì)胞培養(yǎng)板 ,每孔 1 ml，5%CO2溫箱 37℃培養(yǎng)。唐孟萱等將上述方法與細(xì)胞專(zhuān)著所述方法相比較，傳統(tǒng) 37 ℃水浴方法復(fù)蘇后細(xì)胞存活率為 68.4%，先40℃溶解后37℃恒溫方法復(fù)蘇后細(xì)胞存活率為85.7%。證明其所用方法優(yōu)于傳統(tǒng)方法。
1.2 復(fù)蘇用培養(yǎng)基的選擇
鐘志宏等使用培養(yǎng)基培養(yǎng)基RPMI-1640和DMEM兩種培養(yǎng)基對(duì)HepG2細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞結(jié)果在接種密度為1×104/cm2、血清含量為15%時(shí)，經(jīng)6h培養(yǎng)后細(xì)胞開(kāi)始貼壁，12h后大部分細(xì)胞貼壁，且增值速度最快，4d后可以按1:3的比例傳代。
而用RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞在接種密度為1×104/cm2、血清含量為20%時(shí)，時(shí)，經(jīng)6h培養(yǎng)后細(xì)胞貼壁不明顯，但12h后部分細(xì)胞貼壁，24h后亦大部分細(xì)胞貼壁，且增值速度相對(duì)較慢，5天后可以按1:3的比例進(jìn)行傳代。以上結(jié)果說(shuō)明，使用DMEM培養(yǎng)基既可以節(jié)省血清，細(xì)胞貼壁所用時(shí)間短、增殖速度快，并且傳代細(xì)胞培養(yǎng)也使用DMEM培養(yǎng)基，使用DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行復(fù)蘇，避免了配制不同培養(yǎng)基所帶來(lái)的麻煩，因此在HepG2細(xì)胞復(fù)蘇中推薦使用DMEM培養(yǎng)基。
1.3 復(fù)蘇時(shí)的接種密度
甘起霓等研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)接種密度為1×104/cm2，血清含量為20%時(shí), 細(xì)胞24 后大部分貼壁, 且增殖速度最快, 5d后可按1:3比例傳代；當(dāng)接種密度大于1×104/ cm2和（或）血清含量少于20%時(shí), 細(xì)胞表現(xiàn)為貼壁困難, 出現(xiàn)進(jìn)行性退化; 當(dāng)接種密度小于1×104/ cm2 血清含量為20%時(shí), 細(xì)胞24h后大部分貼壁, 但增殖速度明顯減慢, 約7d后才可按1:3比例傳代。
2.消化酶及消化時(shí)間的選擇
唐孟萱等研究發(fā)現(xiàn)，EDTA+胰酶的消化能力太強(qiáng)，消化時(shí)間不好把握，傳代消化后細(xì)胞死亡較多；EDTA消化能力太弱，消化時(shí)間太長(zhǎng)且不易將細(xì)胞消化完全;用PBS將細(xì)胞洗3次，再加入 0.25%胰酶，覆蓋細(xì)胞約30s后吸去胰酶，37℃放置 2～3 min，顯微鏡下可觀察到細(xì)胞消化適度。鐘志宏等將待傳代細(xì)胞不用PBS洗滌和用pH7.2的PBS洗滌一遍、二遍、三遍后分別用0.25%的胰蛋白酶溶液、0.05%胰蛋白酶-0.53mmol/L EDTA.Na溶液進(jìn)行消化（消化液用量為蓋滿(mǎn)瓶底），觀察時(shí)間為30秒，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10分鐘。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：不用PBS洗滌的細(xì)胞分別用上述兩種酶消化，10分鐘后細(xì)胞仍然消化不完全。
用pH7.2的PBS洗滌一遍、二遍、三遍后的細(xì)胞，再用0.25%的胰蛋白酶溶液消化時(shí)，分別經(jīng)3分鐘、1分鐘和0.5分鐘能完全消化好細(xì)胞。而用0.05%胰蛋白酶-0.53mmol/L EDTA.Na溶液進(jìn)行消化時(shí)，完全消化好細(xì)胞約需3分鐘、1.5分鐘、1分鐘。二者的結(jié)果相符。根據(jù)上述結(jié)果可知，在進(jìn)行HepG2細(xì)胞的消化時(shí)，先用pH7.2的PBS洗滌三遍后，再用0.25%的胰蛋白酶溶液消化0.5分鐘效果比較好。費(fèi)洪新[5]等人則推薦使用如下方法進(jìn)行消化：果明顯，對(duì)細(xì)胞的影響小。一般適宜的消化方法是：用1×PBS將細(xì)胞洗滌2次 再加入適量的0.15%胰蛋白酶（含有0.02%EDTA并以7：3的體積比混合）覆蓋細(xì)胞約20秒后吸去胰蛋白酶 （含有0.02%EDTA并以7：3的體積比混合）。
3.培養(yǎng)基中血清濃度的選擇
由于人肝癌 細(xì)胞株生長(zhǎng)緩慢，惡性程度較高，對(duì)于血清的要求比較嚴(yán)格，其培養(yǎng)時(shí)所需要胎牛血清的濃度要比一般的腫瘤細(xì)胞高一些。些經(jīng)驗(yàn)，費(fèi)洪新等人認(rèn)為在含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中HepG2人肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)迅速。鐘志宏、王爽等人的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也支持上述結(jié)果。甘起霓則認(rèn)為血清含量為20%時(shí), HepG2細(xì)胞貼壁后增殖速度最快。當(dāng)HepG2細(xì)胞增殖數(shù)代后, 待其狀態(tài)穩(wěn)定時(shí), 可將血清含量逐漸降至10%。唐孟萱[1]等人則認(rèn)為12%的血清濃度足以滿(mǎn)足HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)。
4.雙抗?jié)舛鹊倪x擇
王爽等通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選發(fā)現(xiàn)，雙抗?jié)舛葹?.5%時(shí)傳代效果較好，條件易于控制，且細(xì)胞能順利生長(zhǎng)。
5.培養(yǎng)基pH條件的選擇
鐘志宏等人實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)復(fù)蘇細(xì)胞和傳代細(xì)胞在pH6.8-7.4、5%CO2條件下培養(yǎng)，其貼壁和增值速度無(wú)明顯變化。
而無(wú)CO2條件下培養(yǎng)時(shí)，復(fù)蘇細(xì)胞在不同pH值條件下均表現(xiàn)為培養(yǎng)液逐漸變堿性，細(xì)胞不能貼壁，且逐漸縮小，退化；傳代細(xì)胞在不同pH值條件下培養(yǎng)，其培養(yǎng)液逐漸變酸性,當(dāng)pH值﹥7.0時(shí)，經(jīng)24h培養(yǎng)后，細(xì)胞基本貼壁，但增值緩慢，經(jīng)48h培養(yǎng)后大部分細(xì)胞已伸出偽足，細(xì)胞數(shù)量明顯增多；當(dāng)pH值﹤7.0時(shí)，細(xì)胞貼壁困難，經(jīng)72h培養(yǎng)后，細(xì)胞縮小、呈退化趨勢(shì)。王爽等通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選發(fā)現(xiàn)，pH7.2時(shí)傳代效果較好，條件易于控制，且細(xì)胞能順利生長(zhǎng)，與上述結(jié)果相符。
6.細(xì)胞傳代條件的選擇
王爽等通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)對(duì)HepG2細(xì)胞的傳代條件進(jìn)行優(yōu)選，他推薦在細(xì)胞匯合度達(dá)95%-1000%時(shí)進(jìn)行傳代。
唐孟萱等人的研究結(jié)果表明HepG2 細(xì)胞生長(zhǎng)至匯合度50%～95%時(shí)是對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,死細(xì)胞相對(duì)較少;而當(dāng)匯合度達(dá)到 100%時(shí) ,生長(zhǎng)趨于平臺(tái)期 ,死細(xì)胞數(shù)開(kāi)始增加;特別是匯合度 100%以后再繼續(xù)培養(yǎng),死細(xì)胞數(shù)明顯增加而活細(xì)胞數(shù)減少。據(jù)此可確定 HepG2 細(xì)胞培養(yǎng)最佳的傳代時(shí)期是在匯合度 95%～100%之間。二者的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符，推薦在匯合度在95%-100%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代。
今天先學(xué)到這里啦，一會(huì)要去吃午飯，然后等老板通知叫我去找他，商量人生大事！?。∽Ｎ液眠\(yùn)吧！?????
后續(xù)
- 我回來(lái)啦~ ??現(xiàn)在是晚上9點(diǎn)半，下午和老板從3點(diǎn)半聊到4點(diǎn)半，聊了好多，有實(shí)驗(yàn)方面的，還有考博方面的~
- 師姐說(shuō)：“HepG2,Huh7，hepa1―6，這是我現(xiàn)在有的，Hep 3B和MHCC97H這兩株在北京的李師姐那邊，H22訂了在路上”
- 我要做的細(xì)胞系：HepG2,Huh7，Hep 3B和MHCC97H，兩外兩株hepa1―6和H22是鼠源的暫時(shí)用不到
- 老板讓我補(bǔ)一下后面幾個(gè)circRNA的圖，我要去接著補(bǔ)圖了！明天又有一節(jié)生信課，到時(shí)候還是會(huì)這簡(jiǎn)書(shū)記錄學(xué)習(xí)筆記！886ヾ(?ω?`)o??
