朋友們，我已經(jīng)更新了更好版本的學習筆記：
第一次看到以下這種質粒map的時候，我的腦袋是空白的，最近在師兄的指導下，也做了一些轉化、擴增、提質粒、酶切和連接等工作。但是實際上我對質粒的結構不是很明白，有時候師兄在說一些東西我沒能完全理解透，等到自己琢磨的時候遇到問題回去再問，師兄會說，我已經(jīng)跟你說過了，嚶嚶嚶o(╥﹏╥)o，所以我決定，搬起小板凳好好的把這個給學一學，就算學不完，總算加一點點基礎也是好的。
舉個例子：Puro-Cas9 donor (Addgene #58409)
1. Ori
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https://zh.wikipedia.org/wiki/Ori
Ori指的是脫氧核糖核酸序列上有一個固定的復制起始點，有時也被叫做origin。在原核生物中，如大腸桿菌（E.coli）的DNA序列上，在第82等分位點上，便存在有該復制起始點，該點被稱作OriC。該OriC的DNA跨度為245bp，分析它的堿基序列，可以發(fā)現(xiàn)這段DNA是由3組延續(xù)的重復序列與2對反向的重復序列所組成的。
在細菌的接合生殖過程中，在oriT ('T'是transfer的縮寫) 的FAT質粒序列上開始以滾環(huán)式復制的模式進行DNA復制。
不同于原核生物僅有一個復制起始點，真核生物中往往有多個復制起始點，并且是分開復制而并不是同步復制的，即時序性；且復制起始點比E.coli的OriC要短。如酵母菌的DNA復制起始點僅僅包含11bp的富含AT的核心序列，又叫做自主復制序列（ARS,autonomous replication sequence）。
在許多生物的線粒體DNA中包含有兩個Ori序列。在人類中，他們被稱為oriH和oriL，前者位于該線粒體的重鏈DNA，后者位于該線粒體的輕鏈DNA。每一個Ori序列都是線粒體的復制起始點。
2. CAP binding site
CAP，Catabolite activator protein 激活蛋白
https://en.wikipedia.org/wiki/Catabolite_activator_protein
CAP結合位點，顯然是為CAP蛋白準備的。
Catabolite activator protein (CAP; also known as cAMP receptor protein,****CRP) is a trans-acting transcriptional activator that exists as a homodimer in solution.
Each subunit of CAP is composed of a ligand-binding domain at the N-terminus (CAPN, residues 1-138) and a DNA-binding domain at the C-terminus (DBD, residues 139-209).[[1]](https://en.wikipedia.org/wiki/Catabolite_activator_protein#cite_note-Busby-1)[2] Two cAMP (cyclic AMP) molecules bind dimeric CAP with negative cooperativity. Cyclic AMP functions as an allosteric effector by increasing CAP's affinity for DNA. CAP binds a DNA region upstream from the DNA binding site of RNA Polymerase. CAP activates transcription through protein-protein interactions with the α-subunit of RNA Polymerase.
**(i) catalyzing the formation of the <u>RNAP-promoter closed complex</u>; and (ii) isomerization of the <u>RNAP-promoter complex to the open confirmation</u>. CAP's interaction with RNA polymerase causes bending of the DNA near the transcription start site, thus effectively <u>catalyzing the transcription initiation process.</u> **
3. lac promoter and operator
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https://en.wikipedia.org/wiki/Lac_operon
promoter for the E. coli lac operon
The lac operon (lactose operon) is an operon required for the transport and metabolism of lactose in Escherichia coli and many other enteric bacteria. Although glucose is the preferred carbon source for most bacteria, the lacoperon allows for the effective digestion of lactose when glucose is not available through the activity of beta-galactosidase.
大腸埃希菌及其他腸桿菌消化乳酸的操縱子，promoter是啟動子，啟動子后面跟著操縱子的基因，結合在一起才可以起作用，另外圖上紫色的部分，都是各種引物
4. M13 REV
M13 REV : common sequencing primer, one of multiple similar variants
M13 fwd: common sequencing primer, one of multiple similar variants
5. T3 promoter and HA-L, HA-R
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5.1 T3 promoter：如圖所示
5.2 HA-L: left homology arm from the adeno-associated virus integration site (AAVS1) within intron 1 of the human PPP1R12C gene; HA-R: right homology arm from the adeno-associated virus integration site (AAVS1) within intron 1 of the human PPP1R12C gene.
這里需要補充AAVS1的相關背景知識，我就不補充了，但是一定要了解這個位點。
6. SA，T2A and puro-R
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6.1 SA：splice acceptor site
6.2 T2A：2A peptide from Thosea asigna virus capsid protein （相應的還有F2A，P2A，E2A等等，主要是來源不同）
6.3 puro-R：puromycin抗性基因
https://en.wikipedia.org/wiki/2A_self-cleaving_peptides
T2A的存在，能夠把融合蛋白拆開來表達~
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7. bGH poly(A) signal
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bovine growth hormone polyadenylation signal
https://baike.baidu.com/item/%E5%8A%A0%E5%B0%BE%E4%BF%A1%E5%8F%B7/4791563
http://www.novopro.cn/articles/201607201130.html
bGH即是較弱的加尾信號
poly(A) tail：真核生物mRNA的3’端都有一段） [1] ，這種尾巴不由基因編碼，而是在轉錄后加到mRNA上的。加尾過程受位于終止密碼3’端的加尾信號序列所控制。 在結構基因的最后一個外顯子中有一個保守的AATAAA序列，此位點下游有一段GT豐富區(qū)或T豐富區(qū)，這兩部分序列共同構成poly(A)加尾信號。
哺乳動物細胞表達質粒主要是用于轉錄出mRNA， 常用的轉錄終止子有SV40, hGH, BGH, 和rbGlob，同時包含有AAUAAA基序促進聚腺苷酸化和轉錄終止。除了上面列出的，SV40 late polyA 和rbGlob polyA被認為可以更加有效的終止轉錄。
有一點特別需要注意的是，哺乳動物細胞的poly(A)信號和病毒包裝系統(tǒng)的聯(lián)合使用可能會降低病毒滴度，延長轉錄本的壽命，所以處理的時候需要謹慎一點。因為這個原因，病毒載體通常會使用其他非poly(A)的轉錄本穩(wěn)定元件和出核元件，如WPRE和CTE或者使用其他弱的poly(A)信號，如BGH 。
拜托以后看到加粗字體的內(nèi)容，就知道這是一個轉錄終止子的信號哦~
8. attB1 and attB2
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Gateway BP reaction
http://www.dxy.cn/bbs/topic/25258654
Gateway也可以被視為一種克隆操作平臺：把目的基因克隆到入門載體（Entry Vector）后，就不用依賴限制性內(nèi)切酶，而靠載體上存在的特定重組位點和重組酶，高效、快速地將目的基因克隆到其它的受體載體（Destination Vector，目的載體）上。
Gateway的原理也是建立在噬菌體DNA定點整合到細菌宿主基因組上。在噬菌體和細菌的整合因子（INF、Int）的作用下，lambda的attP位點和大腸桿菌基因組的attB位點可以發(fā)生定點重組，lambda噬菌體DNA整合到大腸桿菌的基因組DNA中，兩側產(chǎn)生兩個新位點：attL和attR。這是一個可逆的過程，如果在一個噬菌體編碼蛋白Xis和IHF、Int的共同介導下這兩個新位點可以再次重組回復為attB和attP位點，噬菌體從細菌基因組上裂解下來。這一過程的方向是受控于兩個重要因素：存在的介導蛋白和重組位點。
在Gateway系統(tǒng)中,入門載體包含兩個重組位點序列attL1和attL2，大小均為100bp，中間夾著一個自殺基因——ccdB基因。由于ccdB基因的表達產(chǎn)物能抑制普通的E.coli生長，在克隆時沒有切開或者自身環(huán)化的載體在轉化時不能生長。在構建含目的基因的入門載體時必須切掉這個基因，接入目的基因。ccdB基因兩端可以選擇的酶切位點有限（2個），同時還必須考慮讀碼框架、啟動子、終止密碼等問題，因此Gateway系統(tǒng)提供了5種不同的入門載體以供選擇。需要特別注意的是轉化用的菌株必須是不含F(xiàn)附加體的，因為它表達的一種產(chǎn)物能阻斷ccdB基因，影響篩選結果。
同樣，目的載體（Destination Vector）也必須和Gateway系統(tǒng)配套，即目的載體的表達調(diào)控元件下游有兩個重組位點attR1和attR2，大小均為125bp，同樣也夾著一個ccdB自殺基因。
bipartite nuclear localization（NLS）signal from nucleoplasmin （核纖溶酶的二部核定位信號 ）
https://en.wikipedia.org/wiki/Nuclear_localization_sequence
A nuclear localization signal or sequence (NLS) is an amino acid sequence that 'tags' a protein for import into the cell nucleus by nuclear transport. Typically, this signal consists of one or more short sequences of positively charged lysines or arginines exposed on the protein surface. Different nuclear localized proteins may share the same NLS. An NLS has the opposite function of a nuclear export signal (NES), which targets proteins out of the nucleus.
9. SV40 NLS, 3xFLAG, Kozak sequence, attB1, tight TRE promoter and tet operator
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9.1 SV40 NLS，我們上面提到過
They found significantly higher nuclear localization efficiency of c-Myc NLS compared to that of SV40 NLS，他們發(fā)現(xiàn)c-Myc NLS比SV40 NLS的和定位效率更高。說明這兩個都是一個核定位因子，與上面提到的一致。
NLS is an amino acid sequence that 'tags' a protein for import into the cell nucleus by nuclear transport. NLS是一個可以標記蛋白的氨基酸，以便于被和細胞核轉運體轉運到細胞核中，實現(xiàn)核定位功能。
9.2 3xFLAG
three tandem FLAG? epitope tags, followed by an enterokinase cleavage site. 三個串聯(lián)FLAG?表位標簽，接著是腸激酶裂解位點 。
9.3 Kozak sequence
vertebrate consensus sequence for strong initiation of translation (Kozak, 1987) 脊椎動物共有的，轉錄的強啟動因子
9.4 attB1 上面提到過
9.5 tight TRE promoter and tet operator
Tet-responsive promoter PTight, consisting of seven tet operator sequences followed by the minimal CMV promoter
10. T7 promoter
T7: promoter for bacteriophage T7 RNA polymerase
11. ccdB
ccdB, a bacterial toxin that poisons DNA gyrase。 ccdB就是前面在gateway reaction里面提到過的自殺基因，ccdB是一種細菌毒素，可以破壞DNA旋轉酶。
12. AmpR
這個就不說了。
