作者，Evil Genius
現(xiàn)在發(fā)一篇NC也是相當不容易啊，今天我們分享文獻
是一篇10Xvisium call mutation的文章，值得大家借鑒。
多組學是未來的方向，大家如果對基因組 + 單細胞空間組的聯(lián)合分析感興趣，可以參加一下生化小課---基因組與單細胞空間多組學
知識積累
皮膚鱗狀細胞癌（cSCC）起源于皮膚角質形成細胞，完全演化的皮膚鱗狀細胞癌常出現(xiàn)破壞p53和Notch信號通路的體細胞突變。
此外，它們還可能存在激活MAPK/PI3激酶通路、上調端粒酶活性、擾亂SWI/SNF染色質重塑復合物、破壞細胞周期檢查點調控及/或抑制Hippo信號通路等突變。
皮膚鱗狀細胞癌起源于表皮角質形成細胞。攜帶p53或Notch突變的角質形成細胞克隆斑塊可見于表皮中，其密度隨累積日光暴露量增加而升高。日光性角化病作為皮膚鱗癌的低風險癌前病變，很可能源于這些克隆斑塊。盡管已有研究對日光性角化病進行測序分析，但由于其復雜的克隆結構，其遺傳驅動因素仍未完全闡明。
結果1、正常人類皮膚單個角質形成細胞的突變譜研究總結
研究對從正常人體皮膚分離的單個角質形成細胞的突變譜進行了系統(tǒng)性分析，并與同一活檢樣本中的黑色素細胞和真皮成纖維細胞進行比較。
技術流程：采用改良的單細胞基因分型工作流程。通過體外克隆擴增單個皮膚細胞，獲取足量DNA/RNA后進行測序，并結合生信分析以高特異性鑒定體細胞突變。
潛在偏差：克隆擴增過程可能對能成功生長并用于分析的細胞類型產(chǎn)生選擇偏倚。為減少偏差，研究優(yōu)化了培養(yǎng)條件，并比較了單細胞與bulk測序結果，以評估不同方法對突變檢測的可能影響。
樣本來源：來自15名供者的22份皮膚活檢，共分析了137個角質形成細胞、131個黑色素細胞和23個成纖維細胞。
取樣部位：涵蓋不同習慣性日光暴露程度的部位（臀部、軀干、頭/頸部）。
核心發(fā)現(xiàn)
突變負荷的細胞類型差異
角質形成細胞的中位突變負荷最低（1.14 突變/Mb），顯著低于黑色素細胞（3.91 突變/Mb）和成纖維細胞（1.92 突變/Mb）。
這種差異在同一活檢內(nèi)的不同細胞類型間也存在，提示是細胞類型本身的特性，而非個體間差異。
日光暴露皮膚（如上背部）的角質形成細胞突變負荷高于防曬部位（如臀部），但其差異幅度遠小于其他細胞類型（尤其是黑色素細胞）。
角質形成細胞內(nèi)的異質性及關鍵突變的影響
盡管大多數(shù)角質形成細胞突變負荷較低，但部分細胞負荷極高（最高達49.71 突變/Mb）。
關鍵發(fā)現(xiàn)：所有突變負荷 >3.5 突變/Mb 的角質形成細胞，均攜帶至少一個已知的皮膚鱗癌致病突變。其中，攜帶具有顯性負效應的TP53錯義突變的細胞，其突變負荷最高。
這表明：野生型角質形成細胞（即無致病突變）具有強大的適應機制以維持低突變負荷；而某些致病突變（如TP53突變）會破壞這種機制，誘導產(chǎn)生“突變表型”。
突變特征分析
角質形成細胞、黑色素細胞和成纖維細胞的突變類型存在差異。
雖然角質形成細胞中也存在與紫外線相關的SBS7a特征，但其在總突變中的占比低于黑色素細胞和成纖維細胞。
角質形成細胞中，與衰老和細胞分裂累積相關的“時鐘樣”特征（SBS1、SBS5）所占比例更高。
關于突變負荷維持機制的探討
野生型角質形成細胞如何在長期環(huán)境暴露中維持低突變負荷，機制尚不完全清楚。
研究進行了體外UV照射實驗，發(fā)現(xiàn)存活的角質形成細胞比存活的黑色素細胞積累了更多突變。這提示體內(nèi)機制可能更為復雜，涉及三維結構、慢性暴露及細胞選擇性清除等。
與bulk測序的比較及拷貝數(shù)變異
單細胞測序顯示的突變類型與已發(fā)表的表皮bulk測序數(shù)據(jù)高度一致，但單細胞檢測到的平均每細胞突變負荷低于基于bulk數(shù)據(jù)推斷的數(shù)值。差異可能源于隨機抽樣、表皮中其他高突變細胞類型的混雜，或克隆擴增對低突變細胞的偏好。
體細胞拷貝數(shù)改變在正常皮膚細胞中不常見（角質形成細胞中發(fā)生率5.8%），且通常只影響基因組的小部分區(qū)域，表明染色體不穩(wěn)定性并非正常皮膚細胞的主要突變機制。
正常皮膚角質形成細胞普遍具有較低的體細胞突變負荷，顯示出對UV損傷的強大耐受或修復能力。然而，一旦獲得特定的驅動基因突變（如TP53），這種穩(wěn)態(tài)將被打破，導致突變率急劇升高，這可能是皮膚鱗癌發(fā)生的關鍵早期事件。角質形成細胞在突變特征和負荷維持機制上，與同處表皮基底層、接受相似UV劑量的黑色素細胞存在顯著差異。
角質形成細胞克隆性擴增及其與突變的關系
核心發(fā)現(xiàn)：研究發(fā)現(xiàn)，來自同一活檢樣本的角質形成細胞之間存在共享的體細胞突變，這證實了它們具有克隆相關性，即來源于同一個祖細胞。
角質形成細胞在正常皮膚中存在廣泛的克隆性擴增。盡管某些驅動基因突變（如TP53）會顯著提高單個細胞的突變負荷，但它們并未賦予該突變克隆明顯的生長優(yōu)勢，使其在面積上顯著超過周圍的正常細胞克隆。這提示，在癌前病變階段，這些初始驅動突變可能主要作用是破壞基因組穩(wěn)定性（誘導突變表型），而非直接驅動克隆的快速擴張。
結果2、驅動光化性角化病進展為鱗狀細胞癌的遺傳改變
通過病理標記區(qū)分組織區(qū)域，并對DNA進行深度測序（使用癌癥基因panel）。
病灶間的克隆關系復雜：
出乎意料的是，在16例中有6例，相鄰的AK與cSCC不共享任何體細胞改變，表明它們是獨立起源的克隆，盡管位置毗鄰。
在另外4例中，cSCC區(qū)域沒有發(fā)現(xiàn)獨特的突變，暗示AK和cSCC屬于同一個克隆細胞群，組織學差異可能源于表觀遺傳或腫瘤微環(huán)境因素，而非新的遺傳驅動事件。
明確從AK進展的cSCC的遺傳演變路徑：
在剩余5例明確由AK進展而來的cSCC中，通過分析共享和獨有的突變，構建了進展的遺傳圖譜。
示例病例分析：
AK階段已存在：TP53、NOTCH1、NOTCH2和CDKN2A的功能喪失突變，以及TERT啟動子的功能獲得突變。
進展至cSCC階段新增：ARID2（破壞SWI/SNF染色質重塑復合物）和CBL（激活MAPK信號通路）的功能喪失突變。
未檢測到明顯的拷貝數(shù)變異，但發(fā)現(xiàn)影響CDKN2A基因的9p染色體臂等位基因失衡。
免疫組化驗證：p53陽性存在于AK和cSCC；磷酸化MAPK信號在cSCC中更強，與CBL突變相符。
AK向cSCC的轉化并非必然的線性過程，相當比例的相鄰病灶為獨立克隆。在明確進展的病例中，AK階段已積累TP53、NOTCH通路和CDKN2A等關鍵驅動突變及TERT激活；而向侵襲性cSCC的過渡，則可能由額外的、涉及染色質重塑（如ARID2）和MAPK通路激活（如CBL）的遺傳事件驅動。組織學差異有時可能不依賴于新的遺傳驅動突變。
分析了一項已發(fā)表的公開研究數(shù)據(jù)，該研究對皮膚鱗狀細胞癌（cSCC）及相鄰皮膚（包括日光暴露皮膚、光化性角化?。ˋK）或原位鱗癌）中的160個已知癌癥基因進行了測序。分析結果與本研究觀察到的模式一致：多數(shù)病例中鱗癌與鄰近皮膚克隆無關，部分病例中鱗癌可能向相鄰區(qū)域延伸，僅少數(shù)病例（3例）明確顯示鱗癌由鄰近癌前病變演化而來。
綜合本研究5例及公開數(shù)據(jù)3例（共8例明確由癌前病變演化的鱗癌），發(fā)現(xiàn)了共同的演變規(guī)律：p53與NOTCH通路突變、細胞周期檢查點失活及端粒酶上調等改變位于系統(tǒng)發(fā)育樹主干，驅動光化性角化病形成；而SWI/SNF染色質重塑復合物破壞及RAS/MAPK/PI3K信號通路激活的突變則集中出現(xiàn)在向鱗癌轉化的階段。
通過對比未匹配隊列中完全演化鱗癌與正常皮膚的驅動突變頻率，進一步驗證：TP53和NOTCH突變在正常皮膚中已較常見，屬于早期選擇事件，其中TP53突變雖在正常皮膚中少于NOTCH1突變，卻在鱗癌中更常見，提示其賦予角質形成細胞更強的惡性潛能；而CDKN2A、ARID2等基因突變在正常皮膚中罕見卻在鱗癌中常見，表明它們屬于腫瘤演化后期的選擇事件。需注意，因正常皮膚數(shù)據(jù)使用小基因panel測序，此比較存在一定局限性。
結果3、對鱗狀細胞癌鄰近光化性角化病的空間轉錄組學分析
為解析腫瘤演化過程中的基因表達變化，研究對5例克隆關系已明確的、鄰近光化性角化?。ˋK）的鱗狀細胞癌（cSCC）樣本進行了空間轉錄組學（10X Visium）分析，以克服傳統(tǒng)bulk RNA測序無法解析克隆空間關系的局限。
揭示腫瘤克隆的復雜空間結構
通過從Visium數(shù)據(jù)中推斷拷貝數(shù)變異，發(fā)現(xiàn)了與DNA測序數(shù)據(jù)一致的克隆特征。
關鍵發(fā)現(xiàn)：空間數(shù)據(jù)揭示了衛(wèi)星克隆細胞群的存在，它們在物理位置上遠離主腫瘤病灶，這與DNA測序中觀察到的區(qū)域間低水平交叉污染現(xiàn)象相符。
解析腫瘤內(nèi)部的細胞狀態(tài)異質性
spot聚類主要依據(jù)細胞類型，其次為細胞狀態(tài)。
與bulk數(shù)據(jù)一致，cSCC區(qū)域平均表達更高水平的干細胞、祖細胞和間充質基因。
重要的空間異質性：具有干細胞樣特征的spot只存在于cSCC的侵襲前沿（即先前定義的腫瘤特異性角質形成細胞TSKs）。
無論是AK還是cSCC的較深區(qū)域，都保留了與基底層、基上層、棘層和角質細胞分化相關的基因表達程序，表明腫瘤保留了廣泛的上皮細胞狀態(tài)譜系，即使腫瘤進展，其層級分化程序依然存在。
揭示腫瘤微環(huán)境的空間異質性
免疫細胞分布：免疫浸潤常見于AK和cSCC的邊界區(qū)域。
免疫檢查點分子的空間表達：
在cSCC的侵襲前沿，腫瘤細胞高表達免疫檢查點配體（如PVR, NECTIN2, CD274, CD80, CD86）。
相應地，該區(qū)域的淋巴細胞也高表達免疫檢查點蛋白（如CTLA4, TIGIT, PDCD1）。這提示腫瘤侵襲前沿存在強烈的免疫調節(jié)相互作用。
局限性：本研究分析的cSCC在組織病理學上均為高分化。未來需要納入分化表型更廣的腫瘤，以更好地刻畫瘤內(nèi)異質性。同時，未來研究需要對更多具有明確系統(tǒng)發(fā)育關系的cSCC-癌前病變配對樣本進行分析，以闡明免疫表型在進展過程中的演變。
總結一下
關鍵驅動突變的時序與功能
早期啟動（癌前階段）：
TP53和NOTCH1突變在正常表皮角質形成細胞中已出現(xiàn)，其主要作用并非直接賦予克隆生長優(yōu)勢（突變克隆大小并未更大），而是誘導“突變表型”，顯著提高細胞的突變積累速率，為癌變儲備遺傳變異。
FAT1突變（抑制Hippo通路）在正常表皮中亦有發(fā)現(xiàn)。
癌前病變形成（光化性角化病/AK階段）：
CDKN2A功能喪失突變和TERT啟動子突變在AK中反復出現(xiàn)，是促進腫瘤形成的重要步驟。
惡性轉化（進展為cSCC階段）：
ARID2突變（破壞SWI/SNF染色質重塑復合物）和RTK-RAS-MAPK通路的功能獲得性突變在AK向cSCC的轉化階段特異性富集，是驅動侵襲性癌變的關鍵晚期事件。
腫瘤克隆的空間結構復雜性
cSCC常與鄰近的癌前病變（AK）無克隆相關性，表明皮膚上常同時存在多個遺傳上獨立的腫瘤性增殖克隆，并可能發(fā)生“碰撞”。
空間轉錄組分析顯示，腫瘤區(qū)域是腫瘤性克隆與非腫瘤性克隆的復雜嵌合體，克隆邊界在二維空間上不連續(xù)。這提示組織學邊界可能無法準確反映腫瘤的真實范圍，對臨床評估具有重要意義。
腫瘤微環(huán)境與免疫互作
腫瘤內(nèi)存在顯著的基因表達空間異質性。AK和cSCC內(nèi)部均保留了類似于正常表皮的分化層級結構，但cSCC細胞整體分化程度更低。
免疫浸潤的組成在腫瘤內(nèi)部存在差異。在cSCC的侵襲前沿，腫瘤細胞高表達免疫檢查點配體，而該區(qū)域的淋巴細胞也高表達相應的免疫檢查點蛋白。
這表明免疫應答在AK階段即已啟動，可能形成了致癌增殖與免疫清除的平衡狀態(tài)。而向cSCC的進展可能涉及獲得通過免疫檢查點進行免疫逃逸的能力。SWI/SNF復合物突變在此轉化階段常見，可能與驅動免疫逃逸有關。
臨床轉化展望
本研究鑒定出的遺傳改變有望作為改進角質形成細胞癌診斷和預后的候選生物標志物。
鑒于臨床上正常的皮膚中廣泛存在具有高突變負荷的TP53突變角質形成細胞，未來研究可探索免疫療法是否也能靶向并清除這些癌前細胞，作為一種潛在的預防策略。
最后來看看方法
