前言
這次學(xué)習(xí)的本體是來(lái)自劍橋大學(xué): Vladimir Kiselev, Tallulah Andrews, Davis McCarthy and Martin Hemberg幾位大佬建立的course→Analysis of single cell RNA-seq data以及來(lái)自哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院的 McCarroll Lab的Computational resources的CookBook
NOTIFICATION！:10月30號(hào)和11月1號(hào)有了重大更新，目前僅介紹最新的background，方法學(xué)等更新和學(xué)習(xí)后再論述
取得翻譯許可
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——Vladimir Kiselev
正文
第二代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展給生物學(xué)的研究帶來(lái)了極大突破。高通量測(cè)序現(xiàn)已被用于研究的各個(gè)領(lǐng)域，Bulk RNA-seq作為其中的突出代表，在比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)，疾病研究中發(fā)揮著極大的作用。然則其功能依然有著相對(duì)薄弱的地方，例如表達(dá)水平是一群細(xì)胞的相對(duì)平均水平，對(duì)于復(fù)雜的表達(dá)時(shí)刻變化的系統(tǒng)無(wú)法使用，對(duì)于基因表達(dá)的特性也無(wú)法研究。
所以single cell RNA-seq的技術(shù)也應(yīng)運(yùn)而生，這種技術(shù)首先由M Azim Surani及湯富酬創(chuàng)建于2009年，發(fā)表于NATURE METHOD:Tang, Fuchou, Catalin Barbacioru, Yangzhou Wang, Ellen Nordman, Clarence Lee, Nanlan Xu, Xiaohui Wang, et al. 2009. “mRNA-Seq Whole-Transcriptome Analysis of a Single Cell.” Nat. Methods 6 (5): 377–82.
但是直到14年隨著方法的成熟與測(cè)序成本的降低這種方法才漸漸的進(jìn)入大家的視野。
Single-cell 工作流程 OVERVIEW
原理
以Nanoliter Droplets方法為例：
Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets
首先是組織處理得到單細(xì)胞，包裹在單個(gè)的microparticle里面，而microparticle里面又存有包含polyT的beads，于是可以結(jié)合mRNA反轉(zhuǎn)成為cDNA，建成pool進(jìn)行PCR擴(kuò)增，最后混合所有的STAMPs高通量測(cè)序得到數(shù)據(jù)。
每個(gè)micro particle上面的序列由四個(gè)部分組成：
- 一段一樣的序列，PCR handle用于后續(xù)的PCR擴(kuò)增
- bead特異性的barcode，10 - 12bp，用來(lái)區(qū)分單個(gè)細(xì)胞，理論上存在4^12 (16,777,216)個(gè)barcode，也就是說(shuō)最多可以處理1600W個(gè)細(xì)胞
- UMI，Unique Molecular Identifier，4 - 8bp，每個(gè)beads上理論存在4^8 (65,536)個(gè)UMI，用來(lái)區(qū)分transcripts，理論上可以區(qū)分6W個(gè)轉(zhuǎn)錄本
- 30bp的oligo-dT，用來(lái)捕捉mRNA完成反轉(zhuǎn)錄
數(shù)據(jù)分析流程
這個(gè)課程呢，主要關(guān)注scRNA-seq的到的數(shù)據(jù)處理，mark黃色的部分呢，是適用于高通量測(cè)序的數(shù)據(jù)處理流程；mark橙色的部分呢，則是需要利用已有的處理RNA-seq的工具和一些新開發(fā)的區(qū)分scRNA-seq的方法；mark藍(lán)色的部分，就是需要專門的處理scRNA-seq的軟件來(lái)探究這里面的生物學(xué)意義了。
現(xiàn)有挑戰(zhàn)
單細(xì)胞RNA測(cè)序區(qū)別于混池RNA測(cè)序的地方在于每個(gè)測(cè)序庫(kù)（sequencing library）都代表著一個(gè)單細(xì)胞，所以我們應(yīng)該將著眼點(diǎn)放在比較單個(gè)不同細(xì)胞上（或細(xì)胞群），這種測(cè)序庫(kù)（sequencing library）的差異來(lái)源于一下兩個(gè)方面：
- Amplification：擴(kuò)增偏差，單個(gè)細(xì)胞初始轉(zhuǎn)錄本的捕捉效率和低輸入會(huì)導(dǎo)致這樣的偏差
- Gene ‘dropouts’ ：基因丟失，有些基因會(huì)在某個(gè)細(xì)胞里檢測(cè)到具有中等表達(dá)水平卻在其它細(xì)胞里面沒有被發(fā)現(xiàn)
以上兩點(diǎn)也正式目前研究較多的領(lǐng)域，大家都致力于消除這些偏差使得數(shù)據(jù)更具有可分析性
實(shí)驗(yàn)方法
Overview of experimental methods for generating scRNA-seq data
目前單細(xì)胞測(cè)序領(lǐng)域非?；馃幔┠陙?lái)涌現(xiàn)出很多測(cè)序方法，包括但不限于：
- CEL-seq
- CEL-seq2
- Drop-seq （原理介紹使用的方法）
- InDrop-seq
- MARS-seq
- SCRB-seq
- Seq-well
- Smart-seq
- Smart-seq2
- SMARTer
- STRT-seq
但是即使測(cè)序辦法繁多豐富，但根底里是需要面對(duì)兩個(gè)問題：quantification（定量）和 capture（捕捉）
Quantification（定量）
關(guān)于quantification（定量），目前存有著兩種處理方式：full-length（全長(zhǎng)） and tag-based（標(biāo)簽依賴）
full-length的處理方法旨在對(duì)每個(gè)轉(zhuǎn)錄本獲取統(tǒng)一的測(cè)序覆蓋度，相反tag-based處理方法只捕捉mRNA的5'或3'端，定量處理方法的選擇取決于你后期想要分析的目的。
理論上，full-length的處理可以提供一個(gè)相對(duì)平均的測(cè)序覆蓋度，但是就目前的結(jié)果來(lái)說(shuō)還是存在著很多bias。
而tag-based的優(yōu)勢(shì)在于它可以結(jié)合UMI（前面介紹過(guò)）來(lái)提高定量的水平，缺點(diǎn)在于未捕捉完全的轉(zhuǎn)錄本序列，在比對(duì)的時(shí)候無(wú)法區(qū)分iosform (Archer et al. 2016)
Capture（捕捉）
捕捉RNA的策略決定了你的產(chǎn)出，細(xì)胞如何被選擇包括是否攜帶額外信息都值得大做文章。三個(gè)被廣泛運(yùn)用的方法包括：
- microwell-based
- microfluidic-based
- droplet-based
microwell-based
簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，這種方法就是把單個(gè)細(xì)胞利用laser capture或者example pipette的技術(shù)分離到微流體孔里面。這種技術(shù)的既有優(yōu)勢(shì)在于可以結(jié)合FACS分選技術(shù)，根據(jù)細(xì)胞表面marker挑選出的合適的細(xì)胞亞群，并且可以對(duì)細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行記錄，找出并丟棄損傷細(xì)胞或粘連的非單個(gè)細(xì)胞。這個(gè)技術(shù)的缺陷在于由于分選的局限性導(dǎo)致的低通量，和相匹配的較大的工作量。
microfluidic-based
以Fluidigm’s C1舉例，其提供了一個(gè)整合的細(xì)胞捕獲系統(tǒng)，并可以執(zhí)行建庫(kù)前的反應(yīng)，所以相對(duì)于microwell-based方法有更高的通量。
但其弊端在于其只能捕獲10%左右的細(xì)胞，所以不太適合應(yīng)用于有較少樣品量或者樣品較為珍惜的情況。
droplet-based
這種技術(shù)就是我以上介紹的原理的例子，通過(guò)納升級(jí)別的攜帶beads的小液滴，捕獲單個(gè)細(xì)胞，并在液滴內(nèi)完成建庫(kù)，其優(yōu)勢(shì)在于可以定量的鑒別每個(gè)cell內(nèi)的轉(zhuǎn)錄本數(shù)量，劣勢(shì)在于測(cè)序深度低，往往一個(gè)細(xì)胞只有小幾千個(gè)轉(zhuǎn)錄本被檢測(cè)到。
What platform to use for my experiment?
老生常談
適合的即是最好的。
你所選用的決定于你想要研究什么樣的生物學(xué)問題。
假如想要定義一個(gè)組織內(nèi)細(xì)胞的組成成分，那么droplet-based方法是較為有效的，因?yàn)樗梢圆蹲降较鄬?duì)大數(shù)量級(jí)的細(xì)胞。
換一個(gè)方面來(lái)說(shuō)，加入想要去研究一群數(shù)量有限而又知道細(xì)胞表面分子marker的細(xì)胞，那么FACS分選接測(cè)序才是較好的方案。
想要研究可變剪切轉(zhuǎn)錄本，自然需要全長(zhǎng)測(cè)序的實(shí)驗(yàn)方案，這個(gè)時(shí)候tag標(biāo)簽和UMI就成了異常雞肋的存在（當(dāng)然在定量中還是舉足輕重的，要看如何取舍了）。
Enard團(tuán)隊(duì)(Ziegenhain et al. 2017) 和Teichmann團(tuán)隊(duì) (Svensson et al. 2017) 的通過(guò)對(duì)同一個(gè)樣本(mESCs)的測(cè)序和分析比較了現(xiàn)存于市場(chǎng)上的幾種測(cè)序方法，在控制細(xì)胞輸入數(shù)量和測(cè)序深度的時(shí)候，作者得以探究的不同實(shí)驗(yàn)方案特有的敏感性/噪音水平/花費(fèi)，結(jié)論可見下圖：
可以發(fā)現(xiàn)，不同的實(shí)驗(yàn)方案至多會(huì)造成兩倍的實(shí)驗(yàn)差距，實(shí)驗(yàn)方案的抉擇從一開始就決定了你的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的好壞。
針對(duì)檢測(cè)準(zhǔn)確性和敏感性的探究則使用了人工合成的已知濃度的spike-in來(lái)進(jìn)行。
當(dāng)然啦，隨著時(shí)間的進(jìn)展，實(shí)驗(yàn)方法的提高和數(shù)據(jù)分析手段的開發(fā)，我們對(duì)于這些單細(xì)胞測(cè)序方法會(huì)有更深層次的了解，但就目前而言，這個(gè)研究可以很好的幫助科研工作者選擇他適合的工具并完成他的目的。
