一、illumina測(cè)序原理
illumina的底層原理就是基于可逆終止的、熒光標(biāo)記dNTP來做邊合成變測(cè)序的工作。
工作流程主要有四個(gè)步驟：
- 樣本準(zhǔn)備（文庫(kù)構(gòu)建）：
將DNA片段化，就是將基因組DNA用超聲波打斷，然后用酶將兩端補(bǔ)平，接著在3‘端加上一個(gè)A堿基；
在3’端將帶有dA尾的DNA片段與adapter進(jìn)行連接，連接好的DNA混合物就是文庫(kù)（library），接頭包含了index和測(cè)序結(jié)合片段。 - 簇生成（就是一個(gè)擴(kuò)增的過程）
lane表面會(huì)通過共價(jià)鍵接上一些寡聚核苷酸引物，用來與測(cè)序結(jié)合片段結(jié)合。
將文庫(kù)接到flowcell上，文庫(kù)會(huì)和lane表面的寡聚核苷酸引物結(jié)合進(jìn)行pcr，pcr完成后加入氫氧化鈉堿溶液將一條鏈沖洗下去。
加入中性溶液，將lane表面復(fù)制完成的鏈與lane表面的另一端寡聚核苷酸引物結(jié)合，進(jìn)行橋式pcr。重復(fù)這一過程，知道有足夠的簇。然后通過切除基團(tuán)的方式去除反向鏈。
ps：
Flowcell ：流動(dòng)池，就是一張芯片，如Hiseq2500有2張flowcell，即一次運(yùn)行的測(cè)序量；
Lane：每張flowcell上通常都有多個(gè)通道，每個(gè)通道可以單獨(dú)測(cè)不同的樣品。 - 測(cè)序
通過3‘端的疊氮基團(tuán)來暫時(shí)終止合成，通過熒光基團(tuán)來識(shí)別堿基。然后通過化學(xué)試劑切除疊氮基團(tuán)和熒光基團(tuán)，即可逆終止，邊合成邊測(cè)序。
在第一次讀段結(jié)束后，進(jìn)行index的讀取，每個(gè)樣本都有特定的接頭，每個(gè)接頭都有特定的序列，即index。index讀取是為了識(shí)別樣本的來源，需要先洗去讀段產(chǎn)物，然后加入index1的測(cè)序引物，進(jìn)行第二輪測(cè)序，一般是六到八個(gè)堿基。
如果是雙端測(cè)序，接下來就需要進(jìn)行反向測(cè)序，先加入index2的引物進(jìn)行測(cè)序，通過聚合酶完成橋式pcr的擴(kuò)增，洗脫后留下反向鏈進(jìn)行測(cè)序，得到read2序列。 - 分析數(shù)據(jù)
連續(xù)序列與參考基因組進(jìn)行比對(duì)，來進(jìn)行突變識(shí)別。
Illumina測(cè)序原理詳解
二、測(cè)序相關(guān)
常用數(shù)據(jù)格式.png
測(cè)序歷史.png
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