A single-cell atlas of the peripheral immune response in patients with severe COVID-19

影響因子： 36.13PMID：32514174期刊年卷：Nat Med 2020 07; 26（7）

醫(yī)學(xué)一區(qū) 細(xì)胞生物學(xué) Q1 2/190

DOI：10.1038 / s41591-020-0944-y

COVID-19與外周免疫活性的改變有關(guān)，包括可能由一部分炎性單核細(xì)胞，淋巴細(xì)胞減少和T細(xì)胞衰竭產(chǎn)生的促炎細(xì)胞因子水平升高。為了闡明在嚴(yán)重COVID-19中可能導(dǎo)致免疫病理學(xué)或保護(hù)性免疫的外周免疫細(xì)胞途徑，作者應(yīng)用了單細(xì)胞RNA測序（scRNA-seq）來分析7例因COVID-19住院的患者的外周血單核細(xì)胞（PBMC） ，其中四人患有急性呼吸窘迫綜合癥，另外六人健康。作者發(fā)現(xiàn)COVID-19中外周免疫細(xì)胞表型的變化，包括異源干擾素刺激的基因，HLA II類下調(diào)和正在發(fā)展的嗜中性粒細(xì)胞群體，該群體與發(fā)生在需要機(jī)械通氣的急性呼吸衰竭患者中出現(xiàn)的漿母細(xì)胞密切相關(guān)。重要的是，作者發(fā)現(xiàn)外周單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞不表達(dá)大量促炎性細(xì)胞因子。作者共同提供了對嚴(yán)重COVID-19的外周免疫應(yīng)答的細(xì)胞圖譜。

主要結(jié)果

七個住院患者用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)8個外周血樣品（RT-PCR）確認(rèn)SARS-CoV-2感染和6個健康對照組。七名患者均為男性，年齡在20至80歲以上。作者在癥狀發(fā)作后2到16天之間收集了樣本；健康對照者無癥狀，4例男性和2例女性，年齡30-50歲（圖1a和擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖1）。從經(jīng)診斷患有急性呼吸窘迫綜合征（ARDS；圖1a）的通氣患者中收集八個COVID-19樣本中的四個。對一名患者（C1）進(jìn)行了兩次采樣：癥狀發(fā)作后第9天，僅需補(bǔ)充氧氣，插管后癥狀發(fā)作后第11天。三名患者在采樣前的某個時候接受了阿奇霉素，這具有潛在的免疫調(diào)節(jié)作用13（圖1a）。五名患者在醫(yī)院接受瑞姆昔韋治療，其中四名在取樣之前。

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圖1：COVID-19患者外周血的成漿細(xì)胞擴(kuò)增和多個固有免疫細(xì)胞亞群的消耗

1. 測序總概況
作者對44,721個細(xì)胞進(jìn)行了測序，每個樣品平均測序了3,194個細(xì)胞（補(bǔ)充表1）。UMAP確定了30個聚類（圖1b，c）。作者計算了每個簇的最高差異表達(dá)（DE）基因，以使用各自的細(xì)胞身份手動注釋簇（圖1b，c，補(bǔ)充表2和方法）。表明COVID-19患者與對照之間存在明顯的表型差異，主要存在于單核細(xì)胞，T細(xì)胞和自然殺傷（NK）細(xì)胞中（圖1b，c）。

2. COVID-19驅(qū)動的細(xì)胞類型比例的變化
接下來，作者量化了COVID-19驅(qū)動的細(xì)胞類型比例的變化。COVID-19患者的一些先天免疫細(xì)胞亞群被耗竭，包括γδT細(xì)胞，漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞（pDC），常規(guī)樹突狀細(xì)胞（DC），CD16 +單核細(xì)胞和NK細(xì)胞，后三種細(xì)胞類型僅在來自ARDS患者的樣本（圖1d）。發(fā)燒后或癥狀發(fā)作后的時間并不能解釋這些趨勢（S2）。作者還注意到COVID-19患者的成漿細(xì)胞比例增加；這些水平在ARDS患者中最高（圖1d），這表明更嚴(yán)重的情況下可以用一個更強(qiáng)大的體液免疫應(yīng)答，類似以前的報告相關(guān)聯(lián)14，15。來自COVID-19患者的周圍成漿細(xì)胞似乎沒有共享特定的免疫球蛋白V基因（圖S3a）。

3. 發(fā)現(xiàn)新型細(xì)胞
最后，僅在ARDS患者中，作者稱之為“正在發(fā)展的嗜中性粒細(xì)胞”的新型細(xì)胞群才顯著增加（圖1d）。這些細(xì)胞表達(dá)編碼中性粒細(xì)胞顆粒蛋白的幾種基因（例如，ELANE，LTF和MMP8；見圖4和補(bǔ)充表2和3）16，但不表達(dá)編碼中性粒細(xì)胞標(biāo)志物的基因，例如FCGR3B和CXCR2（補(bǔ)充表3），并且在UMAP嵌入中占據(jù)了與成漿細(xì)胞相似的空間，而不是經(jīng)典的中性粒細(xì)胞（圖1c）。此外，它們包含表達(dá)細(xì)胞CEACAM8，ELANE和LYZ*，類似于最近描述嗜中性粒細(xì)胞前體細(xì)胞17，18，這表明這些細(xì)胞代表在各個發(fā)育階段的中性粒細(xì)胞。

4. 單核細(xì)胞的更多亞群
接下來，作者分析了單細(xì)胞的更多亞群，因為在COVID-19患者中，該細(xì)胞簇區(qū)域似乎最強(qiáng)烈地重塑（圖1b，c）。單核細(xì)胞簇區(qū)域減小表明CD14 +單核細(xì)胞發(fā)生了強(qiáng)烈的表型轉(zhuǎn)移，而CD16 +單核細(xì)胞卻在消耗（圖2a，b）。作者首先檢查編碼先前報道通過在COVID-19循環(huán)單核細(xì)胞產(chǎn)生的炎性細(xì)胞因子的基因的表達(dá)5，6。值得注意的是，作者沒有發(fā)現(xiàn)促炎性細(xì)胞因子基因TNF，IL6，IL1B，CCL3，CCL4的大量表達(dá)。外周單核細(xì)胞產(chǎn)生的CXCL2或CXCL2（圖2c），表明外周單核細(xì)胞對COVID-19中的假定細(xì)胞因子風(fēng)暴沒有貢獻(xiàn)。（備注：前一篇文獻(xiàn)中否定了這種說法）

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圖2：單核細(xì)胞中強(qiáng)烈的HLA II類下調(diào)和I型干擾素驅(qū)動的炎癥信號是SARS-CoV-2感染的特征

為了確定基因表型驅(qū)動重塑COVID-19樣品中，作者確定了DE基因，途徑和上游調(diào)節(jié)由每個COVID-19樣品的細(xì)胞進(jìn)行比較，以所有健康對照組（圖的細(xì)胞2D和補(bǔ)充表格4 - 24）。編碼HLA類II分子8個基因的至少六個COVID-19樣品相對于健康對照組是下調(diào)的（圖2d），與其他研究一致19，20。通過表達(dá)所有HLA II類編碼基因?qū)蝹€細(xì)胞進(jìn)行評分顯示，這種下調(diào)在所有COVID-19患者中均顯著，但在通氣依賴患者中可能更為明顯（圖2e，f和補(bǔ)充表25）。HLA II類下調(diào)反映在差異調(diào)節(jié)的基因途徑中，包括減少樹突狀細(xì)胞與自然殺傷細(xì)胞之間的串?dāng)_（圖2g和補(bǔ)充表11）。B細(xì)胞中也注意到HLA II類下調(diào)（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖3b，c和補(bǔ)充表10），并且下調(diào)的程度在老年患者中趨于更大（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖4）。非經(jīng)典HLA I類基因HLA-E和HLA-F也被下調(diào)程度較小且樣品較少，而經(jīng)典HLA I類基因HLA-A，HLA-BHLA-C和HLA-C并未持續(xù)上調(diào)或下調(diào)（圖2f）。

此外，至少一個COVID-19樣品中的CD14 +單核細(xì)胞上調(diào)了32種干擾素（IFN）刺激的基因（ISG），但這種IFN信號在所有COVID-19樣品中均不一致（圖2d和補(bǔ)充表4） 。CD14 +單核細(xì)胞中上游調(diào)節(jié)因子的分析顯示，相對于其余COVID-19供體，供體C2，C3和C7中沒有預(yù)測的IFN和IFN調(diào)節(jié)因子（IRF）活性（圖2h）。在其他細(xì)胞區(qū)室（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖中觀察到類似的模式5和6和補(bǔ)充表格18 - 24）。為了對此進(jìn)行正交分析，作者通過數(shù)據(jù)集中已知ISG的表達(dá)對單個CD14 +單核細(xì)胞評分，并再次在供體C2，C3和C7中看到最小的ISG可識別簽名（圖2i和補(bǔ)充表25）。ISG差異的特征不能通過通氣或ARDS來解釋（圖2h，i），但是較高的ISG分?jǐn)?shù)傾向于與年齡呈正相關(guān)，而與發(fā)燒時間之間呈負(fù)相關(guān)（圖2j）。

5. COVID-19樣品中的T和NK淋巴細(xì)胞
先描述T和NK淋巴細(xì)胞存在差異，然后分析差異基因及通路富集分析，最后回歸到表型。
接下來，作者分析了COVID-19樣品中的T和NK淋巴細(xì)胞。TMAP和NK細(xì)胞的UMAP嵌入確定了CD4 + T，CD8 + T和NK細(xì)胞的細(xì)胞表型的顯著差異（圖3a，b）。作者發(fā)現(xiàn)，CD56dim NK 細(xì)胞，一般認(rèn)為通過細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用有助于抗病毒宿主防御21，22，是在呼吸機(jī)依賴患者的主要消耗殆盡，而CD56bright NK細(xì)胞，這被認(rèn)為是IFN-γ的強(qiáng)大的生產(chǎn)者和腫瘤壞死因子α 23，所有COVID-19樣品中顯著耗盡（圖3c中）。此外，作者鑒定出一群增殖性淋巴細(xì)胞細(xì)胞，在大多數(shù)COVID-19患者中似乎增加（圖3c）。由于SARS-CoV-2感染已與細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞衰竭有關(guān)10，作者通過T細(xì)胞和NK細(xì)胞分析了編碼經(jīng)典衰竭標(biāo)志物的基因的表達(dá)。然而，沒有明顯證據(jù)表明COVID-19患者的CD8 + T細(xì)胞衰竭，盡管CD4 + T細(xì)胞中的衰竭標(biāo)志物似乎升高，但這些變化并不顯著（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖7和補(bǔ)充表25）。根據(jù)LAG3的表達(dá)，大多數(shù)COVID-19患者的NK細(xì)胞出現(xiàn)衰竭，PDCD1和HAVCR2（圖3d）。類似于作者在外周單核細(xì)胞中的觀察，作者沒有檢測到T或NK細(xì)胞促炎性細(xì)胞因子基因的大量表達(dá)（圖3e和圖5和8的擴(kuò)展數(shù)據(jù)）；這再次表明，外周血白細(xì)胞促炎細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄不太可能是COVID-19中假定的細(xì)胞因子風(fēng)暴的主要因素。

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圖3：在COVID-19中NK細(xì)胞衰竭和IFN應(yīng)答的異質(zhì)性模式

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接下來，作者從相對于健康對照的COVID-19患者的每個樣本中計算了T和NK細(xì)胞DE基因，并使用這些基因來鑒定富集的基因途徑和上游調(diào)節(jié)劑。NK細(xì)胞在COVID-19患者之間表現(xiàn)出明顯的異質(zhì)反應(yīng)（圖3f和補(bǔ)充表7）。最常見的下調(diào)基因包括FCGR3A，AHNAK和FGFBP2，它們與周圍NK細(xì)胞成熟度有關(guān)24。最常用的上調(diào)基因包括的ISG和NK細(xì)胞活化基因如PLEK和*CD38 *25，26。作者觀察到CD4 +和CD8 + T細(xì)胞中DE基因具有相似的異質(zhì)性，其中最常見的上調(diào)基因是ISG（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖5和補(bǔ)充表8和9）。

對預(yù)測的上游調(diào)節(jié)的分析表明，在NK細(xì)胞，CD4 +和CD8 + T細(xì)胞中，一半的COVID-19分布圖樣本中都沒有明顯的強(qiáng)烈的IFN驅(qū)動反應(yīng)（圖3g，圖5和6的擴(kuò)展數(shù)據(jù)以及補(bǔ)充表格21 - 23）。由于干擾素反應(yīng)的最近的報告說COVID-19在這種反應(yīng)減弱的重要性，27，28，作者評估ISG上調(diào)在不同的細(xì)胞類型，以確定是否進(jìn)行的ISG協(xié)調(diào)所有細(xì)胞類型或個人之間（圖表示3H）。盡管大多數(shù)供體在給定的細(xì)胞類型（例如CD14 +單核細(xì)胞中的IFI27）中某些ISG上調(diào)，但通常ISG上調(diào)在細(xì)胞類型內(nèi)或受試者之間并不統(tǒng)一（圖3h）。此外，作者發(fā)現(xiàn)很少有細(xì)胞因子在大多數(shù)COVID-19患者之間上調(diào)是一致的（圖3i）。這些結(jié)果共同表明COVID-19中的異質(zhì)性外周免疫激活。

接下來，作者分析了漿母細(xì)胞和發(fā)育中的中性粒細(xì)胞的表型，它們似乎與降維在表型上相關(guān)（圖1c）。實際上，當(dāng)僅分析這些細(xì)胞類型時，正在發(fā)育的嗜中性粒細(xì)胞似乎從漿母細(xì)胞呈線性投射，表明這兩種細(xì)胞類型之間存在連續(xù)的細(xì)胞表型（圖4a）。在發(fā)展中的中性粒細(xì)胞中，細(xì)胞的復(fù)雜性（每個細(xì)胞測序的基因數(shù)除以每個細(xì)胞的唯一分子標(biāo)識符（UMI））并不高，這使得這些細(xì)胞不太可能是多重體（擴(kuò)展數(shù)據(jù)，圖9）。）。這些細(xì)胞也不太可能代表具有吞噬B細(xì)胞的粒細(xì)胞，B細(xì)胞是吞噬性淋巴細(xì)胞組織細(xì)胞增多癥（HLH）的特征，可以由嚴(yán)重的急性感染觸發(fā)，因為這些患者沒有HLH的臨床特征。

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圖4：中性粒細(xì)胞的發(fā)育是重度COVID-19患者的特征，可能與成漿細(xì)胞有所區(qū)別
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6.RNA velocity分析細(xì)胞分化軌跡，確定細(xì)胞類型改變的原因
為了分析是否有這兩種細(xì)胞類型之間的任何過渡，作者通過RNA velocity分析29，30。出乎意料的是，該分析表明細(xì)胞表型的線性連續(xù)體代表了從漿母細(xì)胞到發(fā)育中的中性粒細(xì)胞的分化橋梁（圖4a）。在所有ARDS患者中均觀察到該成漿細(xì)胞-嗜中性粒細(xì)胞表型譜，并且該譜與規(guī)范中性粒細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄動力學(xué)無關(guān)（圖S10）。沿著這個分化橋的細(xì)胞失去了編碼規(guī)范性成漿細(xì)胞標(biāo)記CD27，CD38和TNFRSF17的基因的表達(dá)，而依次獲得了編碼初級（DEF3A，ELANE和MPO），次級（CHI3DL1，LCN2和LTF）和第三級（MMP8，MMP9和CAMP）中性粒細(xì)胞顆粒蛋白，類似于典型的中性粒細(xì)胞發(fā)育（圖4b）。推斷潛伏時間的恢復(fù)（僅基于細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄動力學(xué)）也暗示了從漿母細(xì)胞到發(fā)育中性粒細(xì)胞的連續(xù)性（圖4c）。盡管此連續(xù)體開始時的細(xì)胞是由Ig基因的表達(dá)定義的，但嗜中性粒細(xì)胞標(biāo)志物（如CSF3R和MNDA）（編碼髓核分化抗原）（潛伏時間）上調(diào)（圖4d）。

淋巴細(xì)胞向粒細(xì)胞的分化過程并非沒有先例。類似的轉(zhuǎn)變已經(jīng)從B細(xì)胞來描述的巨噬細(xì)胞或粒細(xì)胞，和C /增強(qiáng)子結(jié)合蛋白（EBP）轉(zhuǎn)錄因子家族已經(jīng)在控制這種轉(zhuǎn)分化有牽連31，32。兩個C / EBP家庭成員，CEBPE和CEBPD，髓細(xì)胞性和粒細(xì)胞的兩個已知驅(qū)動程序命運(yùn)33，34，有選擇地通過沿著分化橋（圖細(xì)胞的兩個簇表示圖4e中，f）; 從CEBPE到CEBPD的過渡概括了小鼠中性粒細(xì)胞的發(fā)育35?？偟膩碚f，作者觀察到正在發(fā)展的嗜中性白細(xì)胞種群可能是嚴(yán)重COVID-19感染中ARDS的特征。作者的數(shù)據(jù)表明，這些細(xì)胞可能源自漿母細(xì)胞，但它們也可能代表來自緊急粒細(xì)胞生成的發(fā)展中性粒細(xì)胞36。

局限性:

作者的樣本量很小，僅對外周血進(jìn)行了評估，患者的臨床表現(xiàn)時間有所不同，這可能會影響其轉(zhuǎn)錄情況。

患者用的抗生素阿齊霉素，已經(jīng)公知的免疫調(diào)節(jié)活性處理13，而另一子集用的抗病毒remdesivir，其靶向病毒RNA依賴性RNA聚合酶處理37，38并且尚不具有直接的免疫調(diào)節(jié)作用。

需要進(jìn)一步的研究以進(jìn)一步定義在轉(zhuǎn)錄水平和表型水平上ARDS設(shè)置中觀察到的發(fā)展中性粒細(xì)胞群體的起源和表型。由于粒細(xì)胞通常無法在冷凍保存中存活，因此這些研究將最佳地需要重癥COVID-19患者的新鮮全血樣本。

總體而言，作者使用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)來表征嚴(yán)重COVID-19中的外周免疫反應(yīng)。作者觀察到ARDS患者中SARS-CoV-2感染的免疫細(xì)胞組成和表型顯著變化，以及嚴(yán)重COVID-19的免疫學(xué)特征。這項工作代表了了解嚴(yán)重COVID-19中外周免疫的資源，并為研究COVID-19免疫學(xué)和治療發(fā)展提供了新的方向。

scRNA-seq計算管道和分析

R軟件包Seurat用于數(shù)據(jù)縮放，轉(zhuǎn)換，聚類，降維，差異表達(dá)分析和大多數(shù)可視化45。對數(shù)據(jù)進(jìn)行縮放和轉(zhuǎn)換，并使用SCTransform（）函數(shù)識別可變基因，并進(jìn)行線性回歸以消除由于細(xì)胞復(fù)雜性（每個細(xì)胞的基因數(shù)量，每個細(xì)胞的UMI數(shù)量）或細(xì)胞質(zhì)量（線粒體百分比）引起的不必要的變異讀取，％rRNA讀?。?。使用可變基因進(jìn)行主成分分析，并使用前50個主成分（PC）進(jìn)行UMAP，將數(shù)據(jù)集嵌入二維。

接下來，來構(gòu)建共享的最近鄰圖（SNN; FindNeighbors（）），并使用基于Louvain方法的基于圖的模塊化優(yōu)化算法，將該SNN用于對數(shù)據(jù)集（FindClusters（））進(jìn)行聚類。用于社區(qū)檢測46。盡管對高質(zhì)量細(xì)胞，并在基因回歸上游過濾反光小區(qū)質(zhì)量的，兩個簇被確定，其中65％或正富集基因的100％是線粒體或核糖體來源的，并且這些簇從進(jìn)一步分析中去除47，48。

Seurat執(zhí)行Wilcoxon秩和檢驗的發(fā)現(xiàn)DE基因?qū)τ诿總€簇（FindMarkers（））和來自前一數(shù)據(jù)集進(jìn)行比較的那些標(biāo)記，以公知的細(xì)胞類型特異性基因決定的49，50，51，52，53，54。使用R軟件包SingleR 55確認(rèn)了簇注釋，該軟件包將每個單個細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組與參考數(shù)據(jù)集進(jìn)行比較以確定細(xì)胞身份。雖然聚類通常不足以細(xì)胞毒性T細(xì)胞從NK細(xì)胞中分離12，49SingleR將簇0和11中的大多數(shù)細(xì)胞（分別為94％和76％）識別為NK細(xì)胞。實際上，這兩個簇是數(shù)據(jù)集中唯一顯著富集了NCAM1和FCGR3A的簇（補(bǔ)充表2），因此作者將其標(biāo)注為NK細(xì)胞。作者還觀察到簇22（其中89％的細(xì)胞被SingleR注釋為T細(xì)胞）富含編碼δδTCR恒定鏈TRGC1，TRGC2和TRDC的基因，因此作者將其注釋為γδT細(xì)胞（補(bǔ)充表2）。）。

SingleR將簇24中的大多數(shù)細(xì)胞標(biāo)記為常見的髓系祖細(xì)胞，但是該簇還包含注釋為造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞的七個不同譜系的細(xì)胞。仔細(xì)檢查發(fā)現(xiàn)，該簇由兩組細(xì)胞組成，一組表達(dá)CLC，另一組表達(dá)CD34，因此作者將其標(biāo)記為干細(xì)胞（SCs）和嗜酸性粒細(xì)胞，用于下游分析?？偣苍诖?7細(xì)胞的98％是由分揀注釋為髓細(xì)胞（46％），前髓細(xì)胞（22％），CD34 -前B細(xì)胞（14％）或<Q> HSC G-CSF（17％ ）。盡管這些細(xì)胞表達(dá)了幾個編碼一級，二級和三級中性粒細(xì)胞顆粒蛋白的基因（例如，ELANE，MPO，LTF，CTSG，LCN2和MMP8）與第25類（手動標(biāo)記并由SingleR標(biāo)記為嗜中性粒細(xì)胞）不同，并且不表達(dá)像FCGR3B和CXCR2這樣的典型嗜中性粒細(xì)胞標(biāo)記。因為這些細(xì)胞在不同的發(fā)育階段表現(xiàn)出類似于未成熟中性粒細(xì)胞和祖細(xì)胞的特征17，18，作者注釋這些細(xì)胞為“嗜中性粒發(fā)展細(xì)胞”。

資料可用性

可從Wellcome Sanger研究所主辦的COVID-19 Cell Atlas（https://www.covid19cellatlas.org/#wilk20）下載帶有去標(biāo)識的元數(shù)據(jù)和嵌入的處理后的計數(shù)矩陣。Chan Zuckerberg Initiative在https://cellxgene.cziscience.com/d/Single_cell_atlas_of_peripheral_immune_response_to_SARS_CoV_2_infection-25.cxg/上也提供了可處理的數(shù)據(jù)，供公眾訪問的cellxgene平臺查看和探索。原始測序數(shù)據(jù)可從NCBI Gene Expression Omnibus（登錄號GSE150728）獲得?？梢酝ㄟ^電子郵件將其他材料請求給相應(yīng)的作者。

代碼可用性

可以從GitHub（https://github.com/ajwilk/2020_Wilk_COVID）獲得用于數(shù)據(jù)分析的所有腳本。