組織纖維化和器官功能障礙是包括心力衰竭在內(nèi)的與年齡相關(guān)疾病的標(biāo)志，但這兩種事件是否存在共同的誘發(fā)途徑仍然未知。通過(guò)scRNA-seq、空間轉(zhuǎn)錄組和genetic perturbation，該研究闡明了high-temperature requirement A serine peptidase 3 (Htra3) 通過(guò)降解TGF-β來(lái)維持quiescent心臟成纖維細(xì)胞的特性，是心臟纖維化和心力衰竭的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。壓力超負(fù)荷下調(diào)心臟成纖維細(xì)胞中 Htra3 的表達(dá)并激活 TGF-β 信號(hào)傳導(dǎo)，通過(guò) DNA 損傷積累和誘導(dǎo)衰竭心肌細(xì)胞的分泌表型，引起心臟纖維化和心力衰竭。心臟中 Htra3 的過(guò)表達(dá)抑制 TGF-β 信號(hào)傳導(dǎo)并改善壓力超負(fù)荷后的心臟功能障礙。 Htra3 調(diào)節(jié)的時(shí)空心臟纖維化誘導(dǎo)和心肌細(xì)胞分泌表型在心肌梗塞后的梗塞區(qū)域中特別觀察到。對(duì)人類單心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組和血漿蛋白質(zhì)組的綜合分析表明，IGFBP7 是 TGF-β 下游的細(xì)胞因子，由衰竭的心肌細(xì)胞分泌，是晚期心力衰竭的可靠診斷標(biāo)志物。這些發(fā)現(xiàn)突出了心臟成纖維細(xì)胞通過(guò) Htra3-TGF-β-IGFBP7 通路調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和心臟纖維化的作用，這將成為心力衰竭的治療靶點(diǎn)。
思路總結(jié)
1. Single-cell network analysis identifies Htra3 as a central molecule of cardiac fibroblasts.
Fig 1A：作者分選了TAC2w和sham小鼠心臟的所有非心肌進(jìn)行了10x單細(xì)胞，又額外分選了PDGFR-a成纖維細(xì)胞，進(jìn)行了Smart-seq2單細(xì)胞測(cè)序。
Fig 1B：使用數(shù)據(jù)庫(kù)中1019個(gè)受體和配體 (LR)的表達(dá)譜，作者使用WGCNA構(gòu)建了一個(gè)共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，揭示了心臟中LR的細(xì)胞類型特異性轉(zhuǎn)錄特性。
Fig 1C：根據(jù)受體配體對(duì)構(gòu)建了細(xì)胞互作網(wǎng)絡(luò)
B和C都是使用1019個(gè)LR基因的表達(dá)矩陣做的，區(qū)別是B是WGCNA構(gòu)建的相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)，C是根據(jù)受體配體對(duì)構(gòu)建的互作網(wǎng)絡(luò)。
Fig 1D：和sham相比，TAC2w小鼠心臟出現(xiàn)了I3K-Akt, Rap1和TGF-β通路的高表達(dá)（沒(méi)有區(qū)分細(xì)胞類型）
Fig 1E：細(xì)胞互作結(jié)果顯示，成纖維細(xì)胞和其他細(xì)胞具有最多的互作。
Fig 1F：在TAC2w小鼠上調(diào)的通路中，也出現(xiàn)了多條細(xì)胞外基質(zhì)和膠原形成的通路激活
Fig 1G：隨后作者構(gòu)建了成纖維細(xì)胞的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)Htra3處于網(wǎng)絡(luò)的中心位置。
Fig 1H：Htra3的表達(dá)與心臟成纖維模塊呈顯著正相關(guān)，提示Htra3定義了心臟成纖維細(xì)胞的特性。（Dcn (decorin)和Islr (Meflin)是TGF-β信號(hào)通路相關(guān)分子）
Fig 1I：單細(xì)胞的數(shù)據(jù)也提示了成纖維細(xì)胞特異性的Htra3表達(dá)。
Fig 1J, K：分別在人和小鼠的心臟切片上驗(yàn)證了成纖維細(xì)胞Htra3的表達(dá)。
思路：先細(xì)胞后分子
1. 定位到成纖維：細(xì)胞互作網(wǎng)絡(luò)中成纖維和別的細(xì)胞互作最多+心臟出現(xiàn)纖維化相關(guān)通路的上調(diào)
2. 定位到Htra3：做了成纖維細(xì)胞的WGCNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)Htra3處于核心位置。
2. Cardiac fibroblast Htra3 governs cardiac homeostasis and is downregulated by pressure overload.
為了進(jìn)一步探究Htra3在心臟的功能，作者首先構(gòu)建了Htra3的敲除鼠
Fig 2A-C：Htra3 KO鼠在沒(méi)有做TAC的情況下也出現(xiàn)了心室壁增厚，心腔增大的表現(xiàn)。在輕度壓力負(fù)荷的TAC下，Htra3 KO鼠出現(xiàn)顯著心衰，sham鼠則沒(méi)有這種情況。
Fig 2D：天狼星紅染色染色也顯示和WT相比，Htra3 KO鼠出現(xiàn)了更明顯的纖維化。
Fig 2E：和sham相比，TAC鼠心臟成纖維細(xì)胞出現(xiàn)了Htra3的下調(diào)
Fig 2F：心衰患者的單細(xì)胞測(cè)序結(jié)果也顯示其心臟成纖維細(xì)胞出現(xiàn)了Htra3的下調(diào)
Fig 2G：體外培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞給予牽張刺激后出現(xiàn)Htra3的下調(diào)和Tgfb1的上調(diào)
3. Htra3-induced TGF-β degradation is essential for the prevention of heart failure and fibrosis
為了進(jìn)一步探究Htra3在心臟纖維化中的功能，作者分選了WT和Htra3 KO小鼠Sham/TAC 2W的Pdgfrα+心臟成纖維細(xì)胞，進(jìn)行了Smart-seq2單細(xì)胞測(cè)序。
Fig 3A, B：聚類得到3個(gè)群，軌跡分析得到2條分化軌跡。
Fig 3C：軌跡1 (C1-C2) 主要是由Htra3 deletion引起的，軌跡2 (C1-C3) 主要是壓力負(fù)荷引起的(不管有沒(méi)有Htra3 KO)。
Fig 3D：共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)和隨機(jī)森林分析顯示M1和M17 were mutually exclusive in their module activity.
這兩個(gè)圖放在附件里，但是是對(duì)文章結(jié)構(gòu)很重要的兩張圖。左圖是對(duì)所有細(xì)胞做了
WGCNA分析，得到了不同的模塊，然后對(duì)模塊進(jìn)行了隨機(jī)森林分析，右圖是基于精準(zhǔn)度的重要性排序，選了前兩個(gè)重要性top2的模塊。
參考：WGCNA原理和分析流程；單細(xì)胞WGCNA分析方法+隨機(jī)森林；使用randomForest包進(jìn)行隨機(jī)森林分析；
Fig 3E-G：M1包含參與固有免疫和TLR信號(hào)通路的基因，而且M1的活性在軌跡1和2都被抑制。而且從G圖看，軌跡1和2中M1的抑制都與Htra3的下調(diào)有關(guān)，提示Htra3是維持心臟成纖維細(xì)胞靜息狀態(tài)的關(guān)鍵分子。
Fig 3H-J：M17主要富集到細(xì)胞外基質(zhì)形成和TGF-β信號(hào)通路，而且它的活性在軌跡1和2中都有不同程度的上調(diào)。從J圖看，不管是壓力負(fù)荷還是Htra3的敲除都可以誘導(dǎo)M17的活化，而且兩者在活化M17方面具有協(xié)同效應(yīng)。
這些結(jié)果提示Htra3 basically 抑制TGF-β信號(hào)通路，而壓力負(fù)荷或Htra3敲除可以協(xié)同作用活化TGF-β，引起成纖維細(xì)胞的活化。
隨后作者在體內(nèi)和體外探究了Htra3對(duì)TGF-β的抑制作用
Fig 3K：在對(duì)心臟原代成纖維細(xì)胞進(jìn)行Htra3的過(guò)表達(dá)可以降低TGF-β1和pSmad2/3(TGF-β信號(hào)通路活化的標(biāo)志)的蛋白水平。
Fig 3L：而且Htra3直接和TGF-β結(jié)合，提示Htra3通過(guò)直接與TGF-β結(jié)合降解TGF-β。
Fig 3M：pSmad2/3免疫熒光的結(jié)果提示Htra3敲除和TAC都可以活化Smad2/3，而且兩者同時(shí)存在時(shí)不僅活化了成纖維細(xì)胞的Smad2/3，心肌細(xì)胞的Smad2/3也出現(xiàn)了活化。
而給予TGF-β中和抗體則顯著改善了Htra3 KO小鼠TAC手術(shù)后的心功能和心臟纖維化（附件）。
4. Htra3 repression-induced activation of TGF-β signaling promotes the induction of senescent failing cardiomyocytes.
為了理解活化的TGF-β信號(hào)通路是如何影響心肌細(xì)胞并引起心衰的，作者對(duì)WT和Htra3 KO小鼠Sham/TAC 2W的心肌細(xì)胞，進(jìn)行了單細(xì)胞測(cè)序。
Fig 4A, B：聚類得到4個(gè)心肌細(xì)胞群
共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)和隨機(jī)森林鑒定出模塊M1和M2顯著參與了細(xì)胞分類（附件）。
Fig 4C：Htra3敲除，TAC和兩者協(xié)同分別可以引起心肌細(xì)胞從C1向C2, C3, C4轉(zhuǎn)化。
Fig 4D-F：模塊M1，主要參與線粒體氧化磷酸化和DNA修復(fù)，在軌跡1和2中都被抑制，提示TGF-β信號(hào)通路抑制這些通路基因的表達(dá)。
Fig 4G-I：模塊M2，參與小GTPase信號(hào)通路、TGF-β受體信號(hào)通路、p53信號(hào)通路等，沿著軌跡2在C4細(xì)胞群中顯著激活。
Fig 4J：Htra3 KO和TAC壓力負(fù)荷的協(xié)同作用顯著誘導(dǎo)了心肌衰竭。
Fig 4K：Htra3 KO和TAC壓力組，心肌細(xì)胞出現(xiàn)了DNA損傷相關(guān)基因的表達(dá)。
Fig 4L：M2也包含著多種分泌蛋白的表達(dá)，比如Bmp1, Cxcl12和Igfbp7，提示cardiomyocytes expressing M2顯示出DNA損傷誘導(dǎo)的分泌表型，和senescence-associated secretory phenotypes (SASP)相似。
Fig 4M-O：聚類結(jié)果顯示模塊M9（主要富集到膠原纖維形成蛋白如Tgfb3, Nox4和Postn）也在C4 like M2中顯著活化。
5. TGF-β-induced Nox4 expression and subsequent p53 activation are essential for the induction of failing cardiomyocytes with secretory phenotype.
Fig 5A：為了探究M9中TGF-β誘導(dǎo)的Nox4活化（心肌細(xì)胞中一個(gè)關(guān)鍵的ROS-generating NADPH oxidase）是否參與DNA損傷和心衰的發(fā)展，作者注射了Nox4- shRNA AAV9來(lái)抑制Nox4的表達(dá)
Fig 5B：超聲結(jié)果顯示knockdown Nox4改善了Htra3 KO鼠TAC后的心功能。
Fig 5C, D, E：免疫熒光和WB的結(jié)果顯示knockdown Nox4顯著降低了DNA損傷和TGF-β信號(hào)相關(guān)分子的表達(dá)。
Fig 5F-J：作者隨后對(duì)TAC 1w WT鼠注射了AAV9-Htra3，Htra3在心臟的過(guò)表達(dá)抑制了TGF-β信號(hào)，減輕了心臟功能惡化和纖維化。
These results suggest that TGF-β signaling induces accumulation of DNA damage and subsequent activation of p53 signaling by repressing DNA repair genes and promoting Nox4-mediated ROS production, resulting in the induction of senescent failing cardiomyocytes, which are characterized by the expression of TGF-β signaling-related molecules and secretory factors. Htra3-induced TGF-β repression might be a therapeutic approach for heart failure.
6. Spatial transcriptome reveals that the Htra3-TGF-β axis is essential for the prevention of cardiac fibrosis and cardiomyocyte secretory phenotype induction in infarct regions after myocardial infarction.
為了進(jìn)一步探究Htra3是如何在空間上調(diào)控心臟重塑，作者在MI模型中探究了Htra3的作用。（空轉(zhuǎn)也是送了WT/Htra3 KO和sham/MI這四組）
Fig 6A：Htra3在MI的梗死區(qū)高表達(dá)，提示它具有潛在的參與心臟重塑的作用。
Fig 6B, C：Htra3 KO鼠顯示出顯著的心臟擴(kuò)張和收縮功能障礙
Fig 6D, E：空間聚類分析得到5個(gè)空間cluster。1群主要在MI組(both KO/WT)，是MI誘導(dǎo)表達(dá)基因，與線粒體基因表達(dá)有關(guān)。2群主要是梗死區(qū)細(xì)胞，與細(xì)胞外基質(zhì)沉積、TGF-β信號(hào)通路、炎癥反應(yīng)、整合素介導(dǎo)的信號(hào)通路等有關(guān)。
Fig 6F：使用單細(xì)胞數(shù)據(jù)對(duì)空轉(zhuǎn)的結(jié)果進(jìn)行注釋，提示成纖維細(xì)胞在2群顯著富集。
Fig 6G-H：對(duì)MI的心肌細(xì)胞做了擬時(shí)序，找到了一些擬時(shí)相關(guān)基因。
Fig 6I：這些基因和細(xì)胞外基質(zhì)基因一起，特異性的在Htra3 KO鼠MI后的梗死區(qū)表達(dá)。
suggesting that Htra3 downregulation promotes cardiac fibrosis and induces cardiomyocyte secretory phenotype in infarct regions.
7. Transcriptomic signatures of failing cardiomyocytes are conserved in human heart failure.
為了驗(yàn)證前面的結(jié)果，作者對(duì)22個(gè)心衰患者和2個(gè)正常對(duì)照的心肌細(xì)胞進(jìn)行了smart-seq全長(zhǎng)單細(xì)胞測(cè)序。
Fig 7A, B：心肌細(xì)胞分為三群，存在兩條分化軌跡。軌跡1是C1-C2，軌跡2是C1-C3。
Fig 7C：正常對(duì)照的心肌主要是C1，患者的則主要是C2/C3。
和前面一樣，作者隨后做了WGCNA和隨機(jī)森林，找到了兩個(gè)核心模塊1和2。這兩個(gè)模塊和前面小鼠心肌細(xì)胞的模塊2和1具有很高的相關(guān)性。前面提到的小鼠M9和人的M44有很好的相關(guān)性。
Fig 7D-F：模塊2（對(duì)應(yīng)小鼠心肌模塊1），富集到的基因主要與線粒體電子傳遞和ATP生物合成有關(guān)，在兩條分化軌跡中都被抑制。
Fig 7G-I：相反，模塊1（對(duì)應(yīng)小鼠心肌模塊2）富集到的基因主要參與I型干擾素反應(yīng)，TGF-β信號(hào)通路，小GTPase信號(hào)通路，DNA損傷反應(yīng)等，在軌跡2中顯著激活。M1還表達(dá)一些在小鼠senescent failing cardiomyocytes中表達(dá)的分泌因子(e.g., CXCL12和IGFBP7)
Fig 7J：M1和M2在心肌細(xì)胞中的模塊活性也是mutually exclusive relationship。
Fig 7K-M：小鼠M9對(duì)應(yīng)的M44，富集到的基因主要與細(xì)胞外基質(zhì)形成有關(guān)，并且特異性的在軌跡2激活。
These results suggest that human failing cardiomyocytes show the same conserved features as murine failing cardiomyocytes, including impaired mitochondrial biogenesis, activated TGF-β receptor signaling, DNA damage response, and fibroblast-like secretory phenotype.
8. IGFBP7, secreted from failing cardiomyocytes, is identified to be a biomarker for progression of heart failure.
為了探究衰竭心肌分泌的細(xì)胞因子是否與心衰進(jìn)程有關(guān)聯(lián)，作者對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)的84例非進(jìn)展期心衰患者、30例進(jìn)展期心衰患者和768例對(duì)照進(jìn)行了血漿蛋白組學(xué)分析。
Fig 7N：senescent failing cardiomyocytes 分泌的細(xì)胞因子如TGF-β3, LTBP4和IGFBP7(在附件)，在心衰患者血漿中都有上升，在移植后則下降，和心衰標(biāo)志物NT-proBNP一樣。
Fig 7O：在這些分子中，隨機(jī)森林法鑒定出IGFBP7是鑒定非進(jìn)展期和進(jìn)展期心衰最強(qiáng)的分類標(biāo)志物。
Fig 7P, Q：ROC結(jié)果提示，NT-proBNP對(duì)心衰診斷效果最好，而IGFBP7確定心衰嚴(yán)重程度效果最好。
These results suggest that IGFBP7, secreted from failing cardiomyocytes, is a useful biomarker for advanced heart failure in humans.
這一篇文章的數(shù)據(jù)測(cè)的相當(dāng)多，做的也比較完善。單細(xì)胞分析比較關(guān)鍵的一個(gè)點(diǎn)是WGCNA+隨機(jī)森林(Fig 2, 4, 7)。這篇文獻(xiàn)做WGCNA是對(duì)單一細(xì)胞類型做的，思路可以參考。
