什么是雙熒光素酶？
雙熒光素酶通常是指螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素。其中熒火蟲熒光素是從螢火蟲中分離得到，分子量為61 kDa；而海腎（Renilla）熒光素酶則是從海腎（Renilla reniformis）中分離，分子量為36 kDa。
兩種熒光素酶的區(qū)別是什么？
①底物和輔因子不同：螢火蟲熒光素酶需要熒光素、氧氣、ATP和鎂離子同時存在才能發(fā)光；而海腎熒光素酶僅需要腔腸素（coelenterazine）和氧氣。
②發(fā)光的顏色不同：螢火蟲熒光素酶產(chǎn)生的光顏色呈現(xiàn)黃綠色，波長550-570nm；而海腎熒光素酶產(chǎn)生藍(lán)光，波長480nm。正是由于這兩種酶的底物和發(fā)光顏色不同，所以在雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)中得到廣泛應(yīng)用，它們的發(fā)光原理如下所示：
以上摘自https://zhuanlan.zhihu.com/p/496542976
簡單來說，F(xiàn)irefly luciferase和Renilla luciferase之所以被稱為報(bào)告基因，是因?yàn)樵诨虮磉_(dá)調(diào)控研究時，利用兩者表達(dá)產(chǎn)生的熒光比值可以監(jiān)控、證實(shí)微觀層面上的分子間的相互作用。具體做法是：將靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件或5’啟動子區(qū)克隆在Firefly luciferase基因的上游，通過目標(biāo)轉(zhuǎn)錄因子與其互作，以研究轉(zhuǎn)錄因子對啟動子的作用。
因?yàn)樽罱谧鲞@個試驗(yàn)，遂記錄步驟，方便今后查看。
步驟
大致分為：擴(kuò)增目的片段、酶切pGreenⅡ 62-sk與pGreenⅡ 0800-LUC載體、連接目的片段與酶切產(chǎn)物、轉(zhuǎn)化DH5α、測序、轉(zhuǎn)化GV3101（psoup）、侵染煙草、利用熒光素酶試劑盒檢測熒光。
1.根據(jù)片段序列，設(shè)計(jì)帶有酶切位點(diǎn)的引物。可以在https://crm.vazyme.com/cetool/singlefragment.html網(wǎng)站進(jìn)行設(shè)計(jì)，載體線性化方式選擇雙酶切，輸入載體完整序列和片段完整片段，輸入5’和3’端接壤的酶切位點(diǎn)（5’與3’分別對應(yīng)片段5’和3’），輸入插入片段的完整序列，即可生成引物序列。
注意：根據(jù)無縫克隆要求，同源臂需要在25bp左右，GC含量在40%-60%，可根據(jù)實(shí)際情況優(yōu)化引物，擴(kuò)增時退火溫度設(shè)置為片段引物的退火溫度-5°左右。
2. 擴(kuò)增片段：以cDNA/DNA為模板，使用高保真酶擴(kuò)增目的片段，并切膠回收。
注意：高保真酶50微升體系，更換新的電泳液，pcr產(chǎn)物＋10微升 6×DNA Loading Buffer，跑膠并膠切回收，得到擴(kuò)增片段。
3.酶切質(zhì)粒：依據(jù)內(nèi)切酶說明書，構(gòu)建酶切體系，加入兩種內(nèi)切酶，加入質(zhì)粒（1微升內(nèi)切酶加入1微克質(zhì)粒），在適當(dāng)溫度下進(jìn)行酶切。得到的酶切產(chǎn)物＋10 微升 6×DNA Loading Buffer 跑膠，未酶切質(zhì)粒5微升＋1微升6×DNA Loading Buffer作為對照跑膠。一般來說，未酶切質(zhì)粒有三條帶，分別為三種構(gòu)象，而酶切成功的載體有一條帶，且比未酶切的質(zhì)粒跑得慢即長度長。將酶切后的線性載體膠切回收后，得到酶切后的載體。
4.連接。依據(jù)無縫克隆試劑盒進(jìn)行連接，按照比例加入片段與酶切后載體，一定反應(yīng)時間后得到連接產(chǎn)物，將其轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)。
5. 挑取單克隆，進(jìn)行菌落/菌液PCR。挑取單克隆至10微升ddH2O，混勻后吸取2微升用于菌液PCR，剩余部分中加入LB及對應(yīng)抗生素，搖床擴(kuò)大培養(yǎng)。
6. 測序。將有正確大小條帶的菌液送測，比對測序結(jié)果。若測序結(jié)果與參考序列一致，則保入菌庫，若不一致，則看是否為同義突變，是否影響結(jié)構(gòu)域，也可以多挑幾個克隆看看。
7．提取序列正確的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至GV3101(psoup)感受態(tài)，挑取單克隆PCR驗(yàn)證。
注意：農(nóng)桿菌不易PCR出條帶，建議更換效率高的高保真酶進(jìn)行擴(kuò)增。
8.選取條帶正確的菌液大搖，至OD為0.5-0.6，收集菌體使用重懸液重懸至OD600為0.8-1。室溫避光放置2-3h后，以轉(zhuǎn)錄因子與啟動子菌液1：1的比例進(jìn)行混合菌液，注射煙草，瞬時轉(zhuǎn)化，2d后取樣。
9.取樣。使用1ml槍頭在每片葉子上進(jìn)行取樣。每個生物學(xué)重復(fù)葉片量為2-4片 1 ml槍頭口取的圓形樣品。
10.熒光測定。液氮研磨樣品后每個生物學(xué)重復(fù)加入200 微升細(xì)胞裂解液，依據(jù)熒光素酶試劑盒進(jìn)行操作。
（底物為試劑盒中所附螢火蟲熒光素酶/海腎熒光素酶底物。50×螢火蟲熒光素酶/海腎熒光素酶底物配置方法：10微升 50×熒光/海腎熒光素酶底物 +490 微升對應(yīng)緩沖液。其他體積類似計(jì)算。）
