森言森語
今天是今年第一次提DNA，不知道為什么，今天加完異丙醇之后直接出現(xiàn)了大量肉眼可見的絮狀沉淀（DNA），神奇的是之前太多次提DNA從來沒有在這一步出現(xiàn)如此大量的絮狀沉淀，往往是在加完異丙醇在-20℃預(yù)冷沉淀，離心之后才有肉眼可見的絮狀沉淀。然后下午繼續(xù)后面的無腦步驟時，不禁再次問自己，提DNA的原理到底是什么？提RNA的原理又是什么？之間的聯(lián)系和區(qū)別又在哪里？說實話，讓我一板一眼的說DNA提取的原理，我還真說不上來，有點扎心。既然我說不清楚，那就很有必要查一查，重新學(xué)習(xí)一下。其實我很好奇，如果畢業(yè)答辯的時候被老師提問了這個問題，幾人能說清楚，哈哈……注意事項：
實驗室常用試劑幾乎都有毒，尤其DNA提取過程中涉及到的試劑也有很強(qiáng)毒性，接觸后會對身體造成不同程度的影響和傷害，長期操作不規(guī)范將對身體造成極大的安全威脅。因此，為了自己和他人的生命安全和身體健康，以下所有步驟均應(yīng)在佩戴后口罩和手套后，在通風(fēng)櫥操作。DNA提取的要求：
- 保證結(jié)構(gòu)的完整性；
- 盡量排除其他大分子成分的污染（蛋白質(zhì)、多糖及RNA等）；
- 保證提取樣品中不含對酶有抑制作用的有機(jī)溶劑及高濃度的金屬離子。
提取步驟及原理：
主要提一下CTAB法提取植物基因組DNA原理。
1 將植物組織置于2 mL離心管，加入2顆滅菌鋼珠，液氮冷凍，球磨儀研碎；
2 加入800 μL CTAB提取緩沖液，65℃水浴1 h，期間每隔15 min顛倒混勻若干次；
說明：CTAB（十六烷基三甲基溴化銨，Hexadecyl trimethyl ammonium Bromide），是一種陽離子去污劑，可溶解細(xì)胞膜并能與核酸形成復(fù)合物，具有從低離子強(qiáng)度溶液中沉淀核酸與酸性多聚糖的特性。在高離子強(qiáng)度的溶液中(>0.7mol/L NaCl),CTAB與蛋白質(zhì)和多聚糖形成復(fù)合物，只是不能沉淀核酸.通過有機(jī)溶劑抽提，去除蛋白、多糖、酚類等雜質(zhì)后加入乙醇沉淀即可使核酸分離出來。
Tris-HCl
提供緩沖環(huán)境，防止核酸被破壞。
EDTA
抑制DNase活性。
NaCl
提供高鹽環(huán)境，使DNA充分溶解。
β-巰基乙醇
抗氧化劑，去除酚、糖，能與酚形成絡(luò)合物，也可與糖結(jié)合。
3 加入800 μL苯酚：氯仿：異丙醇（25:24:1），上下顛倒混勻，12000 rpm離心10 min，將上層水相轉(zhuǎn)移至新的2 mL離心管；
說明：苯酚：從水相中抽提變性的蛋白質(zhì)，抑制DNase的降解作用；氯仿：加速有機(jī)相和水相分層，去除殘留酚；異戊醇：減少蛋白質(zhì)變性操作過程中產(chǎn)生的起泡。4 加入等體積氯仿：異丙醇（24:1），上下顛倒混勻，12000 rpm離心10 min，將上清轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL離心管；
說明：原理同上一步，抽提更徹底。
5 加入0.6倍體積異丙醇，-20℃沉淀30 min以上；
說明：異丙醇用來沉淀DNA，沉淀所需體積小，但難揮發(fā)。
6 12000 rpm離心10 min，棄去上清，加入75%乙醇洗滌兩次；
說明：其實乙醇也可用于DNA的沉淀，其雖易揮發(fā)，但所需體積大，因此普遍使用異丙醇沉淀，然后用乙醇洗滌除去殘留的異丙醇。另外，DNA不溶于乙醇，但CTAB和一些蛋白質(zhì)可溶，低溫乙醇還可抑制DNase活性，降低分子運(yùn)動，易于DNA沉淀。
7 真空干燥儀干燥40 min左右，加水溶解DNA。
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