偶然間翻出來了18年學(xué)習(xí)jimmy的”直播我的基因組系列“所做的一些理解，文章寫于18.7.30，因?yàn)楫?dāng)時(shí)感覺工程浩大，所以遲遲沒有發(fā)出來，但現(xiàn)在我想，“攢著攢著就爛了”，好的內(nèi)容不能浪費(fèi)，不踏出第一步，之前的努力就都白費(fèi)了。當(dāng)然自己可能還有一些理解不到位的地方，后續(xù)內(nèi)容會補(bǔ)充完整

關(guān)于基因組

正常人都是有22對常染色體加XY性染色體。基因組是指生物體所攜帶的一套完整的單倍體序列，也就是22條+X+Y。每個(gè)染色體包括全套基因和間隔序列。他們由A、T、C、G堿基組成，總共長度大約是30億個(gè)堿基。

關(guān)于基因檢測

隨著社會的發(fā)展，人們對于健康愈發(fā)重視，開始涌現(xiàn)了大量的基因檢測，它的個(gè)性化定制再加上后續(xù)的醫(yī)師指導(dǎo)，更加準(zhǔn)確和便捷獲得自身健康信息，預(yù)計(jì)未來會代替?zhèn)鹘y(tǒng)體檢。

基因檢測是在分子水平上對人體遺傳密碼進(jìn)行破譯，通過單核苷酸多態(tài)性和GWAS的分析對人體患病風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行預(yù)測，從而進(jìn)行預(yù)防干預(yù)及個(gè)體化治療。目前全基因組測序成本（30X）已經(jīng)不足一萬元，這種測序就是來檢測全部的30億個(gè)堿基對是如何排列的，得到從第一個(gè)到第30億個(gè)堿基的排列方式。

全基因組檢測幫助確診引起某個(gè)疾病的病因，尤其是癌癥病人；或者指導(dǎo)有家族性后發(fā)遺傳病的病人進(jìn)行有針對性的治療，比如安吉麗娜·朱莉接受預(yù)防性的雙側(cè)乳腺切除。

怎么測： 最常用illumina的二代測序，測序長度在150-250bp，取幾百萬的細(xì)胞破碎后，把所有的染色體隨機(jī)打斷成小片段，一個(gè)個(gè)進(jìn)行測序，會測得上億個(gè)片段

【還有一種是三代測序，不需要PCR過程，直接對每一條DNA分子進(jìn)行測序，長度1w-5w nt（因?yàn)闆]有經(jīng)過PCR，一直是單鏈狀態(tài)測，所以不存在堿基對bp，只能稱之為堿基nt），準(zhǔn)確度要低一些】

測哪里： 也就是測序的樣本從哪里獲得？

唾液？：唾液肯定可以提取出DNA，而且也最方便。但是會混在口腔微生物的DNA，即使后來通過比對人類參考基因組來去除污染，但最后大概三成數(shù)據(jù)是要被浪費(fèi)的。目前基于取唾液興起的基因檢測是測一部分高頻變異位點(diǎn)，那不是做的全基因組測序，是利用基因芯片技術(shù)進(jìn)行，成本在三位數(shù)

23魔方

血液？除非提供者正患有菌血癥（外界的細(xì)菌經(jīng)由體表的入口或是感染的入口進(jìn)入血液系統(tǒng)后，在人體血液內(nèi)繁殖并隨血流在全身播散），一般血液是最純凈的。從血液里面分離白細(xì)胞然后提取DNA的技術(shù)也是非常成熟的。

測序報(bào)告：

處理流程

數(shù)據(jù)來源：

一般推薦：全基因組測序，覆蓋度30X，也就是90G的raw data，測序策略是PE150，采用illumina的HiSeq X，DNA小片段文庫(350bp)進(jìn)行建庫。

幾個(gè)名詞：

• 覆蓋度30X：平均下來能把身體內(nèi)的30億個(gè)堿基每個(gè)都測到30次，因?yàn)闇y序是隨機(jī)的，必然有一些測序深度高一點(diǎn)，有些低一點(diǎn)

  這個(gè)30的標(biāo)準(zhǔn)怎么定的？為什么不是20X或者更高的40、50X？
  有研究做過飽和度分析～看看5~60X的模擬梯度對尋找遺傳變異的能力差異大小，結(jié)果發(fā)現(xiàn)平均深度達(dá)到30X的時(shí)候，可以覆蓋基因組的95%；另外測序深度越高，價(jià)格越貴，30X的高性價(jià)比足夠挖掘到一定量的遺傳變異Sequencing depth and coverage: key considerations in genomic analyses - Nature Reviews (2014)

• 90G raw data：測序深度30X，人類基因組大約30億堿基，而一億10⁸ 就等于1Gb的測序數(shù)據(jù)；拿到的就是3Gb*30X=90Gb。【注意這里的Gb是測序字符的數(shù)量】

• 測序策略PE150:也就是標(biāo)準(zhǔn)的雙端測序模式（Paired End），目前雙端比單端價(jià)格還要便宜，而且一條序列這邊測一次，另一邊測一次，更準(zhǔn)確。所以一般分析基本也沒有用單端的了。150就是這邊測150bp，那邊測150bp?！井?dāng)然打斷的片段一般是大于300bp的，所以每個(gè)reads中間會有一部分測不到，這就對了！畢竟reads是隨機(jī)打斷，也就是打斷的位置不同。雖然這一條reads的中間部分區(qū)域測不到，但是另外的reads就能測到。如果說，一條reads長度200卻采用雙端150bp，那么中間就會有重疊區(qū)域，被測了兩遍，這在高通量測序中是非常浪費(fèi)資源的，每次測都是要花錢的??！】

• Hiseq ：美國Illumina公司作為二代測序儀生產(chǎn)領(lǐng)先企業(yè)，自2006年進(jìn)軍基因測序市場以來，陸續(xù)發(fā)布了HiSeq，MiSeq，NextSeq，NovaSeq等一系列測序儀器。

Hiseq系列～HiSeq 2000，HiSeq 2500，HiSeq 3000，HiSeq 4000
HiSeq系列測序儀問世以來，以通量高，產(chǎn)量大，生產(chǎn)規(guī)模著稱，能夠快速、經(jīng)濟(jì)的進(jìn)行大規(guī)模平行測序，在大型全基因組測序，全轉(zhuǎn)錄組，全外顯子組測序，靶向基因測序方面優(yōu)勢明顯。HiSeq 3000/4000系統(tǒng)基于成熟的HiSeq 2500系統(tǒng)，采用創(chuàng)新的有序流動槽技術(shù)最大限度提高效率，3.5天內(nèi)可完成12個(gè)基因組、100個(gè)轉(zhuǎn)錄組或180個(gè)外顯子組測序

HiSeq X系列——HiSeq X Five，HiSeq X Ten
HiSeq X Ten系統(tǒng)的問世完成了人類歷史上一大里程碑事件——千元基因組時(shí)代的到來。HiSeq X Ten系統(tǒng)是由一套共10臺超高通量的HiSeq X儀器組成，其中每臺儀器可在3天內(nèi)產(chǎn)生高達(dá)1.8 Tb測序數(shù)據(jù)，即每天高達(dá)600 Gb。10臺聯(lián)合工作，每年能帶來超過18,000個(gè)人類基因組，而每個(gè)基因組的價(jià)格約為1000美元，讓癌癥和復(fù)雜疾病的研究達(dá)到新的水平

至于NovaSeq嘛，應(yīng)該是17年開始交付使用，被稱為“史上最貴洗衣機(jī)”的NovaSeq6000，以其酷炫的外形和美麗的價(jià)格（100w美金）成為了高端測序領(lǐng)導(dǎo)者，旨在沖刺“100美元基因組測序”。它的通量更高，運(yùn)行周期48小時(shí)，2個(gè)flowcell每次產(chǎn)生大于2Tb的數(shù)據(jù)。另外還有它兄弟Novaseq 5000，差異就是他們的流動槽，5000可以運(yùn)行S1、S2兩種，6000可以運(yùn)行S1、S2、S3、S4四種，一個(gè)S4流動槽每次運(yùn)行可達(dá)到80-100億數(shù)量的reads / clusters。雙S4流動槽運(yùn)行可以不到兩天內(nèi)解碼48個(gè)人類基因組（6萬億鹼基通量），比雙S2流動槽通量翻三倍

• DNA小片段（350bp）建庫：根據(jù)公司不同，將DNA用超聲波隨機(jī)打斷成一定長度（如350bp），加接頭，作為測序前的準(zhǔn)備工作，

• Gb與GB你混了嗎：

  Gb是測序中的數(shù)據(jù)量，1 Gigabase= 十億堿基。人類全基因組測序得到了90G的原始數(shù)據(jù)，也就是900億堿基。原始數(shù)據(jù)是fastq格式，而fastq格式是這樣的：第二行中一個(gè)堿基對應(yīng)第四行中的一個(gè)測序質(zhì)量
  

  得到的900億堿基，也對應(yīng)900億個(gè)質(zhì)量值，加起來就是1800億個(gè)字符。
  第一行是測序說明，一般是45個(gè)字符，也就是說，每一條測序reads中第一行就有大概45個(gè)字符。
  

  那么多少條reads呢？根據(jù)PE150計(jì)算：測序策略是一條reads包括150bp，現(xiàn)在900億堿基，就對應(yīng)900億/150=60億條reads 。因此第一行總字符是：60億*45=270億個(gè)字符。
  注意到fastq文件共四行，其中1、2、4行的總數(shù)量分別為270億、900億、900億，第三行就是一個(gè)+，基本可以忽略不計(jì)。加起來總共2070億字符。計(jì)算機(jī)中，根據(jù)編碼規(guī)則不同，字符與字節(jié)對換關(guān)系不同。
  

  Fastq文件是ASCII編碼文件，其中每一個(gè)字符就對應(yīng)一個(gè)ASCII碼，也就等于一個(gè)字節(jié)。計(jì)算機(jī)的1 GB（Gigabytes） 是1024³ 個(gè)字節(jié)
  因此，二者對換關(guān)系就是：全基因組測序的90Gb對應(yīng)（2070*10⁸ /1024³ ）=

  193GB計(jì)算機(jī)存儲空間。

  或者更快的計(jì)算： 測序報(bào)告會給出reads數(shù)，如果測序策略是PE150，那么占用硬盤空間大小就是n(reads)(150+150+45)/1024³*

  另外，測序儀下機(jī)后的數(shù)據(jù)都是用gz壓縮后的文件.fastq.gz，能壓縮2.7倍，大概71G左右。

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