B淋巴細胞亦可簡稱B細胞，是來源于骨髓（bone-marrow）的多能干細胞，所以稱為B細胞。其分化過程可分為前B細胞、不成熟B細胞、成熟B細胞、活化B細胞、漿細胞等五個階段。成熟的B細胞主要存在于淋巴結皮質淺層和脾臟的紅髓和白髓的淋巴小結內。B細胞在抗原刺激下可分化為漿細胞，漿細胞可合成和分泌抗體（免疫球蛋白），主要執(zhí)行機體的體液免疫（humoralimmunity）。近年來，隨著生命科學和醫(yī)學行業(yè)的興起，人類對于疾病與健康更加關注，對于直接關乎機體的免疫功能的B細胞而言，其研究愈加火熱。
眾所周知，B細胞很難操縱，在靜息狀態(tài)下特別脆弱，這使得調節(jié)其基因內源性表達或誘導轉基因過度表達變得非常困難。人類B細胞可以通過使用病毒載體進行操縱，然而該方法有諸多缺點。為了便于研究人類B細胞在健康和疾病環(huán)境中的基因功能，迫切需要穩(wěn)健的遺傳操作方案。近日，意大利錫耶納大學，醫(yī)學、外科和神經科學學院的 Federica Nardi和Laura Pezzella等人在European Journal of Immunology期刊上發(fā)表了題為Assessing gene function in human B cells: CRISPR/Cas9-based gene editing and mRNA-based gene expression in healthy and tumor cells 的技術報道類研究論文。在本研究中，作者建立了分別從健康人和血液病患者分離出的原代B細胞中進行高通量mRNA驅動的轉基因表達和基于CRISPR/Cas9的基因敲除流程。基于靜息狀態(tài)下的人體B細胞進行電穿孔實驗的穩(wěn)健操作方案，克服了B細胞難操縱的障礙，這將顯著加速B細胞研究的潛力。
mRNA在傳遞中作為質粒轉染的一種無毒替代物，已應用于一系列脆弱的原代細胞。體外重組純化的Cas9和合成的sgRNA形成的核糖核蛋白（RNP）復合物的電穿孔是一種易于設計的CRISPR/Cas9基因編輯。
在本次實驗中，研究人員使用NEPA GENE NEPA21基因轉染系統(tǒng)對來源于健康人和血液病患者分離出的原代B細胞進行電穿孔實驗并將攜帶綠色熒光蛋白的mRNA導入到細胞內，用以觀察基因的表達和轉染效率。研究人員設置了12次電穿孔條件，最佳的條件使的在電轉后B細胞的存活率>90%，mRNA的轉染效率>90%（圖1A–C）。解凍冷凍保存的B細胞也觀察到相似的電穿孔效率（>90%），但其細胞存活率稍低（85%），從而證實電穿孔條件與細胞冷凍保存條件相容。蛋白質過度表達可以通過調節(jié)mRNA劑量輕松控制（圖1D），通常在電穿孔后96小時通過綠色熒光蛋白反應才能檢測到結果（圖1E）。我們還檢測了通過尿苷-上半尿苷替代導致mRNA免疫原性降低的mRNA結構的化學修飾是否會對B細胞轉染效率產生積極影響。然而，我們沒有觀察到使用含尿苷的mRNA的顯著優(yōu)勢。
隨著電轉技術在B細胞的應用與發(fā)展，研究人員建立了一條分子生物學實驗線，允許以高通量的方式過度表達編碼大量轉基因的mRNA。研究者們建立了一個5步法程序，以產生以96孔格式編碼任何給定轉基因的mRNA（圖1F）。它包括（1）基因特異性引物的自動設計，（2）從任何合適模板擴增轉基因的第一個PCR反應，（3）將純化的PCR產物Gibson連接到含有體外轉錄所需元素的修飾的dRNA2支架上[2]
（4） ，第二次PCR擴增與轉基因C末端的FLAG標簽融合的體外轉錄模板，以及（5）mRNA的體外合成。這種方法可以快速、廉價地生產出純化的mRNA為電穿孔做準備。為了進行實驗驗證，可以通過使用抗Flag標簽抗體（圖1G）進行免疫印跡來方便地驗證轉基因過表達，經驗證，mRNA電穿孔B細胞可用于任何體外或體內檢測。
此外，為了開發(fā)B細胞中KO基因的管道，研究人員優(yōu)化了培養(yǎng)實現(xiàn)穩(wěn)健的B細胞增殖的條件，這是實現(xiàn)基于Cas9的基因編輯的高效性所必需的，對于活力和增殖能力低的B細胞（如CLL細胞）來說尤其具有挑戰(zhàn)性。我們觀察到B細胞對細胞擁擠效應特別敏感，必須以不超過1—2×105個細胞/mL的密度進行電轉。在通過BCR、CD40和IL-4/IL-21刺激B細胞以及對培養(yǎng)物基中細胞板數(shù)的優(yōu)化，使我們能夠在5-6天內對所有測試樣本實現(xiàn)三到五輪細胞分裂。
為了通過CRISPR/Cas9方法建立B細胞KO基因的方案，如圖2A所示的流程。研究人員用較穩(wěn)定的聚谷氨酸RNPs電穿孔B細胞，并使其在電穿孔后5-6天內增殖，這通常使我們在大量人群中獲得>70%的基因KO（圖2B和C）。KO表型可在電穿孔后第3天觀察到，并在B細胞內擴增后進一步增強（圖2D和E）。靶向CD19基因被證明是有用的內部控制，可通過流式細胞術進行簡單評估（圖2B），而敲除細胞周期調節(jié)因子CDC5L（可導致B細胞分裂停滯）可作為B細胞增殖試驗的對照（圖2F）?？傊?，我們的結果表明，為了在靜息B細胞中實現(xiàn)CRISPR/Cas9高靶向效率，有必要且足夠的使用優(yōu)化的電穿孔條件來遞送Cas9 RNP，然后培養(yǎng)B細胞以誘導其增殖。
圖2：人體B細胞中基于Cas9 RNP的KO基因。（A） 人體B細胞中基于CRISPR/Cas9的基因編輯工作流程。（B） 代表性實驗和（C）顯示RNP切除后第5天B細胞表面受體CD19（n=10）或ILT3/LILRB4（n=6）KO的實驗總結。（D） 電穿孔后72小時和120小時，B細胞中CD19 KO的分析。（E）面板D中： CD19染色組織覆蓋情況。（F）CDC5L KO后阻斷B細胞增殖。數(shù)據(jù)點為平均值±SD。（D–F）所示數(shù)據(jù)代表五個（D，E）和三個（F）獨立實驗**p<0.01，****p<0.0001（Mann–Whitney檢驗）
?最后，為了使該方法適用于高通量篩選程序，研究者們建立了30 μL電穿孔體積的電穿孔條件，其中所有試劑和細胞數(shù)量按比例縮小。這種方案降低了對細胞和試劑的消耗，同時實現(xiàn)基因過度表達和基因KO的高效率。因此，本研究中的方法學流程闡明了一種可擴展的方法就是利用體外生產的mRNA或合成的靶向RNA序列評估不同來源的靜息人類B細胞的基因功能。該流程的優(yōu)點包括在不影響細胞的存活率和不需提前擴增的情況下，能夠以高通量方式評估人的原代B細胞中的基因功能，并且可以直接在大量人群中進行應用。還提出了另一個工作流程，就是類似的方案也適應于其他電穿孔系統(tǒng)，并最終適應其他類型的脆弱原代免疫細胞。NEPA21電轉染儀
論文鏈接
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/eji.202149784
參考文獻
1、Nardi, F., Pezzella, L., Drago, R., Di Rita, A., Simoncelli, M., Marotta, G., Gozzetti, A., Bocchia, M. and Kabanova, A. (2022), Assessing gene function in human B cells: CRISPR/Cas9-based gene editing and mRNA-based gene expression in healthy and tumor cells. Eur. J. Immunol., 52: 1362-1365.?https://doi.org/10.1002/eji.202149784
2、 Vriens, K. et al., Nature. 2019. 566: 403–406.
