A single-cell transcriptome atlas of the adult human retina

遺傳性視網(wǎng)膜疾病正成為成人失明的主要原因，當前已鑒定到與視網(wǎng)膜疾病相關的200多個基因，涉及特定的視網(wǎng)膜細胞類型。

先前對于成人和胎兒的視網(wǎng)膜遺傳表達譜已有研究，但是關于視網(wǎng)膜細胞異質(zhì)性的研究較少，對高度分化的視網(wǎng)膜細胞的轉(zhuǎn)錄通路依然不清楚。

因此，了解人類單個視網(wǎng)膜細胞類型的轉(zhuǎn)錄組情況對于解析視網(wǎng)膜中的細胞多樣性以及研究導致單個視網(wǎng)膜細胞類型疾病的視網(wǎng)膜基因非常重要。

本研究通過對三個健康捐贈者視網(wǎng)膜scRNA-seq數(shù)據(jù)進行分析，為人類視網(wǎng)膜細胞類型的轉(zhuǎn)錄組表達譜提供了新的見解，并為人類神經(jīng)視網(wǎng)膜建立了高細胞分辨率的參考對象。

材料：

• 1、三個捐贈者的視網(wǎng)膜scRNA-seq數(shù)據(jù)
• 2、胚胎視網(wǎng)膜數(shù)據(jù)（scRNA-seq）和hiPSC-derived cone photoreceptors(bulk-RNA seq)
  前期捕獲到23000個細胞，經(jīng)質(zhì)控和過濾得到20009個細胞。

數(shù)據(jù)分析：

CellRanger 2.1.0版本
參考基因組：GRch38
Seurat V2.2.1

Identification of major cell types in the human retina using scRNA-seq

• 圖A.B：三個捐贈者的視網(wǎng)膜單細胞轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，使用seurat經(jīng)過濾篩選，獲得20009個細胞，降維聚類形成18個cluster，B展示的是三個樣本cluster分布。
• 圖c-d:基于已知的makers,18個cluster中的16個進行分類，其中c5和c14表達的maker基因來自多個細胞類型，沒有進行定義。從分類看出，視桿細胞有6個cluster，雙極細胞有3個cluster。(每個圓圈的大小表示在集群中表達makergene的細胞的百分比)
• 圖e:鑒定到的18個cluster進行相關性分析，相同的細胞類型高度相似，除此之外，視桿細胞和視錐細胞以及膠質(zhì)細胞和其他視網(wǎng)膜神經(jīng)元有高度相關性。（上面的三角形表示相關的z值，下面的三角形表示聚類中基因表達的相關系數(shù)）
• 圖f:對每個cluster進行差異基因表達分析。（選擇差異基因上調(diào)表達的前10個基因進行展示）

總而言之，我們在提供的數(shù)據(jù)集中對人視網(wǎng)膜中所有主要細胞類型的轉(zhuǎn)錄組進行了分析。由于它們的豐度，在隨后的分析中，我們重點研究了感光細胞（視桿細胞和視錐細胞）和神經(jīng)膠質(zhì)細胞。

Profiling healthy and degenerating human rod photoreceptor subpopulations

分析健康和退化人的視桿細胞亞群

• 圖a:分析14759個視桿細胞，形成6個cluster，選取已知的7個maker基因在16個cluster中熱圖展示，1,6,7表達量在視桿細胞很高，4在視桿細胞和視錐細胞都表達。（棕色表示大于等于100的轉(zhuǎn)錄數(shù)量）
• 圖b：六個視桿細胞亞群三個樣本的細胞所占比列。發(fā)現(xiàn)許多視桿細胞cluster主要來自單個樣本。C3來自三個捐贈者。（這可能是由于系統(tǒng)的偏見，如組織檢索時間的差異，捐贈者的年齡，或其他樣本制備的變異）
• 圖c:為了定義和分類視桿細胞的異質(zhì)性，使用了MALAT1（長的非編碼RNA，在視網(wǎng)膜穩(wěn)定和疾病其重要作用）基因鑒定。約66%的細胞表達高，其余的細胞表達量低。

利用MALAT1表達作為鑒定基因，研究了高表達（MALAT1-hi；每細胞> 4.68標準化轉(zhuǎn)錄本）或低表達（MALAT1-lo；每細胞<4.68標準化轉(zhuǎn)錄本）的視桿細胞之間的差異。

通過MALAT1表達的差異能夠區(qū)分視桿細胞的異質(zhì)性
圖d:利用MALAT1表達分析三個樣本（五個文庫）中MALAT1-hi和MALAT1-lo的細胞比列，三個樣本中高表達分別占66%，90%，36%。

圖e:為了近一步證實，進行的原位雜交。outer nuclear layer （外核層）(ONL). INL, inner nuclear layer（內(nèi)核層）; OPL, outer plexiform layer（外網(wǎng)狀層）

為了排除有樣本變異造成的MALAT1視桿細胞亞群的存在，使用典型性相關分析進行矯正（其用來矯正視桿細胞樣本特異性變異）。

對于CCA，我們使用了所有五個樣品共有的可變性最高的基因，并使用前兩個CC尺寸（通過雙權(quán)中間相關（bicor）分析選擇）對重組數(shù)據(jù)進行了比對。 使用頭20個對齊的CC尺寸以0.6的分辨率在Seurat中重新排列對齊的細胞

• 圖a,b：校正后，視桿細胞亞群形成3個cluster，最終圖中展示了13個cluster。b是三個捐贈者視網(wǎng)膜樣本的展示。
• 圖c：對7個視桿細胞的maker基因進行熱圖展示，
• 圖d,e：對基因MALAT1在視桿細胞的三個cluster的表達豐度的展示，cca0表達豐度低，在cca1和cca10表達豐度高，結(jié)果與原位雜交結(jié)果一致。上述結(jié)果也表明了MALAT1異質(zhì)性并不是由個體之間的差異造成的。
• 圖f:為了檢驗數(shù)據(jù)中是否還有低質(zhì)量細胞，t-sne圖展示8個核糖體蛋白基因，沒有上調(diào)表達。
• 圖g:然而，在clustercca10中有1.4%的細胞表達線粒體基因相關的蛋白，可能該cluster含有低質(zhì)量的細胞。
• 圖4：隨后對不同時間點的視網(wǎng)膜細胞進行原位雜交，結(jié)合上面的結(jié)果表明MALAT1可以作為判斷視桿細胞處于退化還是健康的狀態(tài)。

Transcriptome profile of cone subtypes in the human retina

隨后對視錐細胞進行分析

• 圖a:選取11個maker gene進行分析，通過視錐細胞marker基因的表達，在轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中鑒定到564個視錐細胞。視錐細胞可以根據(jù)表達的視蛋白劃分為三種亞型（s.m.l）,但是m和l蛋白98%是相似的。
• 圖b,c:展示3種視錐細胞亞型在c10cluster中細胞比列。
• 圖d:進一步研究視錐細胞亞群的分子鑒定maker基因及表達豐度，通過篩選的差異基因?qū)σ曞F細胞進行亞群區(qū)分。結(jié)合前人研究結(jié)果和本文數(shù)據(jù)顯示TBX2 marks 是 S-cones 中特異表達,很保守。

Assessment of glial cells in human retina

視網(wǎng)膜神經(jīng)膠質(zhì)細胞評估
主要研究兩類視神經(jīng)膠質(zhì)細胞型：Mu¨ller glia c9, 和 retinal astrocytes c16（視網(wǎng)膜星型膠質(zhì)細胞）

• 圖e：展示了9個在神經(jīng)膠質(zhì)細胞中常用的maker基因。結(jié)果顯示，這9個基因在兩類細胞中的表達水平是不同的。VIM, GLUL, and S100A1兩類細胞高表達； GFAP represents a reliable marker for retinal astrocytes。

通過這些差異基因的表達豐度，可以將兩類細胞型進行區(qū)分。
這些結(jié)果提供了關于人類神經(jīng)膠質(zhì)細胞和視網(wǎng)膜星形膠質(zhì)細胞中已知神經(jīng)膠質(zhì)標記的差異表達模式的見解.

Using the human neural retina transcriptome atlas for benchmarking

為了證明我們的數(shù)據(jù)集可以作為基準參考，將自己數(shù)據(jù)與胎兒的視錐細胞，誘導的多能干細胞形成的視錐細胞進行比較。
圖a:相關性分析，結(jié)果顯示： hiPSC-cone在分化15周后的轉(zhuǎn)錄組表達譜與視錐細胞高度相似，與其他的視網(wǎng)膜細胞相似度很低。

• 圖b：通過主成分分析，展示數(shù)據(jù)之間的相關性。hiPSC-cone與胎兒的視錐細胞比較相近。
  另一個基準測試，評估成年人體內(nèi)細胞與體外細胞系之間的差異
• 圖c:我們將永生的神經(jīng)膠質(zhì)細胞系MIO-M1與我們數(shù)據(jù)集所有視網(wǎng)膜細胞類型進行了比較。使用scRNA-seq，我們對7,150個MIO-M1細胞進行了分析，歸一化后每個細胞具有23,987個讀數(shù)，對應于3421個檢測到的基因。
  聚類和t-SNE分析表明，MIO-M1細胞形成了一個cluster，cluster與數(shù)據(jù)集中的視網(wǎng)膜細胞類型不同。
• 圖d和e:相關性分析顯示：MIO-M1與星形膠質(zhì)細胞相似性更高，e展示的是該類細胞中的基因的表達豐度。

scGPS能夠?qū)⒒旌先悍纸鈉luster（SCORE）并分析cluster之間的關系（scGPS）。 scGPS根據(jù)預測的基因去定義了亞種群。

這個包有兩種算法：SCORE 和scGPS
scGPS從一個或多個未知樣本的scRNA數(shù)據(jù)中劃分亞群以及這些亞群之間的關系。 輸入數(shù)據(jù)集包含混合的、異質(zhì)細胞。 scGPS首先使用SCORE（或CORE V2.0）來鑒定同質(zhì)的亞群。 scGPS可以驗證由SCORE標識的子種群（例如，用于與PCA，tSNE和插補方法CIDR的結(jié)果進行比較的功能）。 scGPS還可以選擇maker gene區(qū)分亞群以及通過富集分析以注釋亞群。

在第二階段，scGPS選擇最佳基因預測并建立可以估計亞種群間過渡分數(shù)的預測模型，亞種群間過渡分數(shù)是來自一個亞種群的細胞可能過渡到另一亞種群的概率。

scGPS
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