PCR引物是指在PCR反應(yīng)中與待擴(kuò)增的靶DNA區(qū)段兩翼互補(bǔ)的寡聚核苷酸，其本質(zhì)是單鏈DNA片段。PCR引物的選擇對(duì)PCR成功與否具有決定性意義，因此，引物的設(shè)計(jì)需要遵循一些基本原則：
引物長(zhǎng)度：一般為15~30個(gè)堿基，過(guò)短會(huì)降低擴(kuò)增特異性，過(guò)長(zhǎng)會(huì)提高退火溫度和引物自身結(jié)合的可能性。
引物序列：應(yīng)與靶DNA完全互補(bǔ)，避免錯(cuò)配或雜交。應(yīng)盡量避免數(shù)個(gè)嘌呤或嘧啶連續(xù)排列，避免同源序列（尤其6個(gè)堿基以上相同）。
引物結(jié)構(gòu)：應(yīng)避免引物自身形成發(fā)夾狀或回文狀的二級(jí)結(jié)構(gòu)，影響引物與模板的復(fù)性結(jié)合。應(yīng)避免兩個(gè)引物之間形成互補(bǔ)或二聚體，影響擴(kuò)增效率和特異性。
引物GC含量：一般為40%~60%，兩條引物的GC含量應(yīng)盡量相似。GC含量過(guò)低會(huì)使引物不穩(wěn)定，過(guò)高會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增或難以解鏈。
引物Tm值：即解鏈溫度，與引物長(zhǎng)度、GC含量和堿基組成有關(guān)。一般為50~65℃，兩條引物的Tm值應(yīng)盡量接近，差異最好在1℃以內(nèi)，最多不超過(guò)5℃。
引物3’端：是延伸開(kāi)始的地方，因此要防止錯(cuò)配或二級(jí)結(jié)構(gòu)。3’末端最后一個(gè)堿基最好是G或C，增加引物的特異性和穩(wěn)定性。
引物5’端：限定了PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度，對(duì)擴(kuò)增特異性影響不大，因此可以被修飾或添加標(biāo)記、位點(diǎn)等，以便于后續(xù)的檢測(cè)、分析或克隆等操作。
引物位置：應(yīng)盡量選擇靶DNA的保守區(qū)域，避免變異或多態(tài)性的影響。如果可能，應(yīng)跨越內(nèi)含子或非編碼區(qū)域，以區(qū)分基因組DNA和cDNA。如果擴(kuò)增的是已知的基因或序列，應(yīng)避免選擇含有重復(fù)序列或低復(fù)雜度序列的區(qū)域。
引物濃度：一般為0.1~1 μM，以最低引物量產(chǎn)生所需結(jié)果為好。引物濃度過(guò)高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增，增加引物間二聚體的形成機(jī)會(huì)。
以上就是PCR引物設(shè)計(jì)原則的文章，希望對(duì)你有所幫助。
