總結昨天膠回收失敗的一天，想好點樣的順序，開始實驗之前一定要仔細研究膠回收試劑盒說明書，準備好試驗過程中要用到的東西，做到心中有數(shù)。停止懷疑自己是實驗成功的關鍵。

Steps：

⒈按單酶切體系點樣（用PCR管），用槍吸打混勻，短暫離心將反應液收集至管底，于37℃水浴2h；
⒉用高保真酶擴增目的基因的上臂UP，點好樣，用槍吸打混勻，短暫離心數(shù)秒，跑PCR；

vazyme高保真酶.png

PCR反應程序.png

⒌Trans2K? DNA Marker和 5kMarker點5μL

⒍記好自己的點樣順序
⒎凝膠成像系統(tǒng)拍照（Image Lab Software）
點擊打開Image Lab → 點擊新建實驗協(xié)議 → 點擊選擇凝膠類型（核酸凝膠-Ethidium Bromide）→ 點擊放置凝膠 → 打開凝膠放置槽放入凝膠 → 點擊運行實驗協(xié)議 → 濾光片位置選擇自動默認 → 確認后開始檢測，彈出圖片 → 在分析工具箱選擇需要調(diào)整的項目 → 在文件欄目下選擇導出--導出以便發(fā)布 → 點擊導出（600dpi） → 選擇保存類型JPJ →保存后關閉軟件及凝膠成像儀
⒏切膠--切膠器（TRANS UV）

利用全式金膠回收試劑盒（EasyPure Quick Gel Extraction Kit）（離心柱吸附）

膠回收試劑盒.png

產(chǎn)品組成.png

原理：
利用異硫氰酸胍法溶膠，利用硅膠膜離心柱特異地吸附DNA，適用于從TAE或TBE瓊脂糖凝膠中回收DNA片段，操作簡單快速。純化得到的DNA可用于酶切、連接、克隆、測序等多種操作。

Prepare：
使用前加不同體積無水乙醇到WB中；
開始試驗前打開55℃水浴鍋，ddH₂O于65℃水浴鍋預熱；
加異丙醇（為增加DNA回收量，按1:1比例，即凝膠重為100mg，加入100μL異丙醇）
所有離心均在室溫下進行。

操作步驟：
切膠（用切膠器，速度要快）→ 稱重 → 加3倍體積的GSB溶液→ 于55℃水浴溶膠10min → 槍轉移至離心柱中靜置1min →10,000×g離心1min，棄流出液 → 加650μL溶液WB，10,000 ×g離心1min，棄流出液 → 空甩1-2min，去除殘留的WB → 將離心柱置于一干凈的離心管中，開蓋靜置1min → 在柱的中央加入40μL預熱的ddH₂O → 室溫靜置1min → 10,000×g離心1min洗脫DNA兩次 → 將洗脫出的DNA于-20℃保存 → 吸取5μL測濃度

注意事項：
⑴ 為了保證回收效果，電泳時使用新鮮電泳緩沖液。
⑵ 切膠時，膠塊盡量?。蝗苣z時，確保膠塊完全融化。
⑶ 為避免紫外照射對DNA造成損傷，影響下游的實驗（如克隆，連接），紫外照射時間盡量短。

Mini point：超微量分光光度計（dsDNA濃度測定）
1μLddH₂O Blank校正
DNA純度：OD₂₆₀/OD₂₈₀=1.8-2.0

濃度測定.png

基因敲除載體的構建.png