一句話簡介：使用sci-ATAC-seq檢測了L2期幼蟲的單細胞染色質(zhì)可及性，探索了秀麗隱桿線蟲各個細胞類型的調(diào)控DNA。

全文鏈接：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC8494234/

背景：

（1）基因表達的特定變化對于細胞狀態(tài)的改變至關(guān)重要，了解基因表達的調(diào)控具有重要意義；目前線蟲已經(jīng)獲得了全面的單細胞基因表達圖譜，而不同細胞類型和生命周期的調(diào)控元件圖譜有待完善；
（2）基因的表達調(diào)控具有高度的細胞類型特異性，缺乏細胞精度的調(diào)控元件圖譜，無法揭示這些調(diào)控事件；即傳統(tǒng)bulk測序構(gòu)建的圖譜：
1. 無法區(qū)分同一基因多個調(diào)控位點是否存在細胞類型特異性；
2. 檢測靈敏度低，部分高度細胞類型特異性的區(qū)域信號可能被噪音掩蓋；
3. 由于存在隨發(fā)育特化激活的區(qū)域，因此可能在解釋差異活性位點時造成誤差；

結(jié)果

1.使用sciATAC-seq檢測秀麗隱桿線蟲中的單細胞染色質(zhì)可及性

為了匹配sci-RNA-seq數(shù)據(jù)，作者將一群同步的野生型線蟲培養(yǎng)至L2中期，然后固定、分離細胞核，進行sci-ATAC-seq, 最終總共收集了30930個細胞的sciATAC-seq數(shù)據(jù)。然后使用LDA(改進的潛在狄利克雷分配模型)對數(shù)據(jù)進行了可及性峰值檢測和細胞聚類。

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• Fig1.迭代峰值調(diào)用過程可從單細胞數(shù)據(jù)中產(chǎn)生更多的可及性峰
  值得注意的是，作者通過檢測每個峰上信號的局部最大值，將具有多個峰值的峰分成了單獨的連續(xù)段，以確保更好地捕獲可能包含多個結(jié)合的可及性區(qū)域。秀麗隱桿線蟲L2期幼蟲的可及性區(qū)域數(shù)據(jù)從如下鏈接獲?。?a target="_blank">http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgTracks ?db=ce11&hubClear=http://waterston.gs.washington.edu/atacTissue/Durham_hub.txt

2.單細胞染色質(zhì)可及性峰與已發(fā)表的Bulk 染色質(zhì)分析的調(diào)控區(qū)域相一致

-- bulk ATAC-seq 與 TF Chip-seq 數(shù)據(jù)
在通過迭代峰值調(diào)用程序之后，總共獲得了36339個單細胞染色質(zhì)可及性峰區(qū)域（多峰拆分之后為38017個峰）。然后作者將數(shù)據(jù)與秀麗隱桿線蟲多生命周期的全線蟲ATAC-seq數(shù)據(jù)(J?nes et al. 2018)和來自 modERN 427個TF chip-seq數(shù)據(jù)（Kudron et al. 2018）進行了比較。

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• Fig2. 從sciATAC-seq中鑒定的可及性峰與整個線蟲中現(xiàn)有染色質(zhì)可及性數(shù)據(jù)鑒定的可及性峰顯示出了相當大的重疊。
  結(jié)果顯示：sciATAC-seq中 25675/38017 （約 66%）個peaks 與bulk ATAC-seq peaks總體重疊（bedtools intersect），總共覆蓋了 20234260 bp的序列（約占基因組 20.2%)。 約81%（30886/38017）的peaks與TF CHIP-seq峰重疊。此外，從相反的角度來看，bulk ATAC-seq中約69%的位點在sciATAC-seq也被檢測了出來。 modERN TF位點中 57%與sciATAC-seq峰重疊，進一步分析發(fā)現(xiàn)不重疊的這些區(qū)域可能是來自非L2期線蟲樣本（Fig2C）。

3. LDA建模揭示了37個細胞簇

為了在組織和細胞類型層面解釋數(shù)據(jù)，作者應(yīng)用LDA對scATAC-Seq數(shù)據(jù)進行了處理，訓練了一個包含55個主題的LDA模型，包括 30870行（過濾檢測峰值太少的細胞），55列按主題劃分的細胞矩陣，以及一個包含32214行和55列的按主題劃分的峰矩陣。接著他們刪除了15個在任何緊密分組的細胞子集中概率都不高的主題，然后將在剩余的40個主題中概率>50%的細胞分配給“主題簇”，其中3個少于50個細胞主題被刪去，最終此過程將總共 24503個細胞分配給了37個主題簇以供進一步分析。

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• Fig3. LDA建模產(chǎn)生了37個主要的細胞簇

4.主題對應(yīng)于特定的組織身份

接下來作者試圖確定根據(jù)37個主題對細胞類型進行聚類之后，這些細胞聚類是否代表不同的細胞類型。注釋主題細胞類型的一種方法是參考已知的基因位點，類似于scRNA-seq數(shù)據(jù)中識別簇的標記基因的方式。由于缺乏此類數(shù)據(jù)，作者采用了如下方法：
（1）尋找每個主題中scATAC-seq峰與細胞類型特異性TF的chip-seq峰的重疊（Fig4）；
（2）利用峰值-基因分配及其相關(guān)表達模式將基因和主題關(guān)聯(lián)起來，計算每個主題前250個特異性峰，然后計算特異性峰對應(yīng)基因的組織表達水平，并計算與隨機基因表達的log2比值，根據(jù)比值分析主題是否特定的細胞類型有關(guān)。

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• Fig4. 每個主題的重要峰與細胞類型特異性TF-Chip 峰的重疊情況

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• Fig 5. 主題特異性峰往往靠近組織特異性基因

確定細胞類型之后，作者比較了細胞核數(shù)量和基于解剖學結(jié)構(gòu)預(yù)期的細胞核數(shù)量之間的一致性。此外，作者再次分析了與TF Chip-seq位點沒有重疊的峰。（1） 與TF Chip-seq重疊的峰值往往在L2期幼蟲中具有更多的細胞（2）沒有重疊的峰仍然有明顯的主題特異性 （3）超過一半沒有重疊峰的對神經(jīng)元或生殖腺有貢獻。由此推測 ChIP-seq可能缺乏找到僅限于L2中少數(shù)細胞特異性調(diào)控位點的靈敏度。因此，我們得出結(jié)論，不與 TF ChIP-seq 位點重疊的 sci-ATAC-seq 峰很可能是高度細胞類型特異性的，或者特定于尚未用 ChIP-seq 測試的 TF。

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• Fig 6. 新的與modeRN ChIP-seq 沒有重疊的染色質(zhì)可及性峰

接著作者分析了組織特異性基因的scATAC-seq 信號，發(fā)現(xiàn)這些基因的染色質(zhì)可及性模式與組織表達模式高度一致（Fig）。hlh -1、pha-4（咽部組織的主要調(diào)節(jié)因子）、elt-1、col-160（在 L2 的無縫皮下組織中表達的膠原基因）、bbs-8（在纖毛感覺和氧感覺神經(jīng)元中表達的受體編碼基因）、unc-47（在 GABA 能神經(jīng)元中表達的基因）、elt-2、T02B11.3（在鞘膠質(zhì)細胞中特異表達的基因）和glh-1（在生殖系中特異表達的基因）均在預(yù)期的組織類型中表現(xiàn)出富集的可及性。數(shù)據(jù)還表明差異亞型表達的模式；

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• Fig 7. 已知組織特異性基因顯示特定主題的染色質(zhì)可及性。

他們發(fā)現(xiàn)了在pha-4基因座上還存在異構(gòu)體特異性染色質(zhì)可及性模式，并探索了具有這一模式的其他基因（Fig S12）

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• Fig S12 具有多個啟動子染色質(zhì)可及性活性的基因提示了異構(gòu)體的使用

5. 對來自單個組織類型的細胞進行LDA建模，可以檢測細顆粒度的細胞類型

（1）基于解剖位置Marker劃分細胞亞型；
（2）神經(jīng)元細胞亞簇劃分

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• Fig 8. 肌肉和腸道細胞的亞聚類根據(jù)前后體軸的位置將它們分開

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• Fig 9. 神經(jīng)元的亞聚類揭示了區(qū)分不同細胞類型的更精細結(jié)構(gòu)。

討論

• 利用sciATAC-seq 繪制了秀麗隱桿線蟲第一張按細胞類型解析的調(diào)控元件圖譜；

關(guān)注點：

• sciATAC-seq與bulk ATAC-seq和 TF Chip-seq的比較分析；
• 如何將LDA建模的主題與細胞身份進行對應(yīng)
  （1）scATAC-seq peaks與組織特異性TF Chip-seq峰的重疊；
  （2）特異性峰匹配基因的組織表達模式
• 如何利用單細胞可及性圖譜進行生物學解釋
  （1）細胞核數(shù)與解剖學細胞數(shù)目比較
  （2）組織特異性表達基因的染色質(zhì)可及性概貌
  （3）異構(gòu)體特異性可及性模式