A Novel DNA Repair Gene Signature for Immune Checkpoint Inhibitor-Based Therapy in Gastric Cancer

一種基于免疫檢查點抑制劑的胃癌免疫修復(fù)基因特征

發(fā)表期刊：Front Cell Dev Biol

發(fā)表日期：2022 May 23

DOI:? 10.3389/fcell.2022.893546

期刊相關(guān)信息

一、背景

????????胃癌是全球最常見的癌癥之一，2020年新發(fā)病例超過100萬，發(fā)病率在全球排名第五，死亡率在全球排名第三。化療是胃癌的標(biāo)準(zhǔn)治療方法，可作為術(shù)前或術(shù)后治療，適用于疾病的所有病理階段。一些治療方案在某些患者中顯示出更好的5年生存率（OS）或無復(fù)發(fā)生存率（RFS）。近年來，多種免疫檢查點抑制劑（ICI）的批準(zhǔn)以及腫瘤免疫療法的臨床試驗所取得的可喜成果，促使了腫瘤免疫療法的發(fā)展。在ICI療法中，抗PD-1和抗PD-L1抗體以及抗CTLA4抗體對微衛(wèi)星不穩(wěn)定性高（MSI-H）亞型或PD-L1高表達的患者非常有效。

????????在某些類型的腫瘤中已經(jīng)觀察到基因不穩(wěn)定或DNA修復(fù)缺陷與腫瘤對免疫療法的敏感性之間的聯(lián)系。已發(fā)現(xiàn)DNA損傷和基因組不穩(wěn)定性會影響抗腫瘤免疫反應(yīng)。腫瘤免疫治療的應(yīng)用仍有許多挑戰(zhàn)，例如，只有一小部分腫瘤是易感的，總體臨床反應(yīng)率較低，仍然難以準(zhǔn)確預(yù)測療效和反應(yīng)。這樣的局限性使得人們有理由尋找新的免疫治療生物標(biāo)志物，如基于PD-L1表達、腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞、TMB、缺失的MMR、免疫基因簽名和多重免疫組化等。

二、材料與方法

1.數(shù)據(jù)來源

1）從癌癥基因組圖譜胃腺癌（TCGA-STAD）數(shù)據(jù)集下載407名胃癌患者的下一代測序數(shù)據(jù)和臨床病理信息

2）從GEO數(shù)據(jù)庫下GSE30727中60名胃癌患者的微陣列數(shù)據(jù)載

3）使用帶有免疫療法信息的數(shù)據(jù)集[R軟件包 "IMvigor210CoreBiologies"]

4）從GDSC下載體外不同胃癌細(xì)胞間的藥物敏感性數(shù)據(jù)

5）公共數(shù)據(jù)集IMvigor210CoreBiologies共包含348名接受阿特唑侖治療的晚期尿道膀胱癌患者

6）從GEO數(shù)據(jù)庫中下載了三個獨立的胃癌數(shù)據(jù)集GSE26901、GSE15459和GSE26899作為驗證集

7）從GDSC下載藥物敏感性數(shù)據(jù)，結(jié)合23種胃癌細(xì)胞的RNA-seq數(shù)據(jù)

8）10名胃癌患者組織切片

2.實驗流程

1） 15-DNA修復(fù)基因特征（DRGS）和評分系統(tǒng)的構(gòu)建：從人類DNA修復(fù)基因網(wǎng)站中，定義了219個DNA修復(fù)基因的名單；差異表達分析；采用PCA作為降維方法，得到15個基因的一維相關(guān)系數(shù)

2） 免疫細(xì)胞浸潤的比較：ImmuCellAI確定DRGS評分系統(tǒng)與胃癌組織中免疫細(xì)胞浸潤之間的關(guān)系；計算了相同的TCGA-STAD樣本的DRGS分?jǐn)?shù)，并使用中位數(shù)分?jǐn)?shù)作為臨界點，將這些樣本分為高分亞型和低分亞型；對兩組之間浸潤分?jǐn)?shù)明顯不同的免疫細(xì)胞進行了分層聚類；使用ImmuCellAI來預(yù)測患者對ICB治療的反應(yīng)

3） 組織學(xué)和分子特征的綜合分析：來自上述兩組的樣本（TCGA-STAD，高分n = 187，低分n = 188）被用來探討DRGS評分與各種腫瘤特征之間的關(guān)系

4） 15-DNA修復(fù)基因特征評分與免疫治療結(jié)果的關(guān)系、預(yù)后能力：生存分析、單變量和多變量的Cox回歸

5） 15-DNA修復(fù)基因特征評分與藥物敏感性的關(guān)系

6） 免疫組化分析：10名胃癌患者組織切片

7） 預(yù)后相關(guān)的15-DNA修復(fù)基因特征和PD-L1表達的驗證：對IHC結(jié)果和人類蛋白質(zhì)圖譜（HPA）的數(shù)據(jù)進行分析

三、實驗結(jié)果

01、15 DNA修復(fù)基因特征的鑒定及評分系統(tǒng)的構(gòu)建

????????從人類DNA修復(fù)基因網(wǎng)站上獲得219個DNA修復(fù)基因，使用R中的DEseq2包來處理TCGA-STAD的原始數(shù)據(jù)，并使用在線平臺GEO2R來尋找腫瘤（n = 375）和正常（n = 32）組織之間差異表達的基因。最后，在219個DNA修復(fù)基因中確定了15個共同的基因，這些基因在TCGA-STAD和GSE30727（腫瘤n = 30，正常n = 30）中均有差異表達（圖1A）。然后用PCA分析作為降維方法，得到15個基因的一維相關(guān)系數(shù)（圖1B）?；谶@些系數(shù)，我們創(chuàng)建了一個15個DNA修復(fù)基因特征（DRGS）評分系統(tǒng)，用DRGS評分將患者分為兩組（高分組和低分組）。

圖1 DNA修復(fù)基因和DRGS評分系統(tǒng)的構(gòu)建

02、不同15-DNA修復(fù)基因特征評分組的免疫特征

????????作者通過ImmuCellAI識別375個TCGA-STAD樣本的免疫特征，以估計每個胃癌樣本中24種免疫細(xì)胞的具體分?jǐn)?shù)。為了分析不同分?jǐn)?shù)亞組（高分n = 187，低分n = 188）的免疫細(xì)胞組成，比較了兩組中免疫細(xì)胞類型的分布。結(jié)果顯示，兩組間14種免疫細(xì)胞的浸潤率存在明顯差異：抗腫瘤細(xì)胞如γδT細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和Th1細(xì)胞在DRGS高分組中更為豐富，而免疫抑制或腫瘤增強細(xì)胞如B細(xì)胞、CD4 T細(xì)胞、單核細(xì)胞、Th17細(xì)胞、Tfh細(xì)胞和Tr1細(xì)胞在DRGS低分組更為豐富（圖2，圖3A）。DRGS低分組樣本的浸潤分?jǐn)?shù)明顯高于高分組（圖3B）。此外，用ImmuCellAI預(yù)測ICB治療的反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)在DRGS高分組中會有53.5%的患者對ICB治療有反應(yīng)，而DRGS低分組的患者較少（37.8%）（圖3C）。

圖2 DRGS高分和低分亞組的免疫細(xì)胞類型浸潤情況

圖3 DRGS得分亞組的免疫特征

03、15-DNA修復(fù)基因特征得分組與其他組織學(xué)和分子分類的關(guān)系

????????為了研究分?jǐn)?shù)分組與其他組織學(xué)和分子分類之間的關(guān)系，作者分析了TCGA-STAD數(shù)據(jù)庫中372個胃癌患者樣本的臨床數(shù)據(jù)。根據(jù)先前研究的分類，胃癌可分為3個亞型，即腸型、彌漫型和混合型。在本研究中，DRGS高分組（n = 115）的特點是腸道亞型樣本的比例非常高（86.1%），而彌漫型和混合型亞型樣本分別只有7.8%和6.1%。另一方面，DRGS低分組（n = 115）由51.3%的腸道樣本、40.0%的彌漫型和8.7%的混合型樣本組成。據(jù)統(tǒng)計，與低分組相比，DRGS高分組的腸道型胃癌樣本明顯較多，彌漫型胃癌樣本較少（圖4A）。

????????TCGA提出了4種胃腺癌亞型：1）EB病毒陽性；2）微衛(wèi)星不穩(wěn)定（MSI）；3）基因組穩(wěn)定（GS）；4）染色體不穩(wěn)定（CIN）。在本研究中，DRGS高分組（n = 169）的EB病毒陽性（11.2%）和MSI（27.8%）亞型樣本的比例較高。相反，DRGS低分組（n = 169）有較高比例的GS（23.1%）和CIN（63.9%）亞型樣本（圖4B）。

????????根據(jù)微衛(wèi)星標(biāo)志物的突變頻率，胃癌可分為MSS、MSI-H和MSI-L。在本研究中，DRGS高分組（n = 120）中MSI-H亞型患者的比例（31.7%）高于低分組（7.5%）（n = 120）。相反，DRGS低分組的MSS亞型患者（72.5%）多于高分組（55.8%）(圖4C)。

圖4 分?jǐn)?shù)分組與其他組織學(xué)和分子學(xué)分類之間的關(guān)系

04、15-DNA修復(fù)基因特征評分的預(yù)后能力

????????為了研究DRGS評分的預(yù)后影響是否獨立于可能與患者結(jié)局相關(guān)的臨床因素，作者首先對TCGA-STAD數(shù)據(jù)集中所有可用的臨床參數(shù)（n = 372）進行單變量Cox回歸分析，選擇了對預(yù)后有重大影響的臨床參數(shù)與DRGS一起進行多變量Cox回歸分析。結(jié)果表明，DRGS是一個獨立的預(yù)后因素。以中位數(shù)為分界值，DRGS高分的患者比DRGS低分的患者有更好的OS（圖5A）。然后，使用GSE26901（n = 109）、GSE15459（n = 192）和GSE26899（n = 93）胃癌數(shù)據(jù)集驗證了評分系統(tǒng)的預(yù)后價值。如圖5所示，GSE26901中DRGS高分組的患者預(yù)后明顯好于低分組的患者（圖5B），與TCGA數(shù)據(jù)集的結(jié)果一致。然而，在GSE15459（圖5C）或GSE26899（圖5D）兩個DRGS組之間沒有明顯的OS差異。

圖5 使用各種公開的胃癌數(shù)據(jù)集的DRGS評分系統(tǒng)的預(yù)后能力

05、15-DNA修復(fù)基因特征評分的分子特征

????????為了確定TMB和DRGS評分之間的關(guān)系，作者分析了TCGA-STAD的365份胃腺癌樣本的體細(xì)胞突變數(shù)據(jù)。結(jié)果表明，DRGS評分與TMB呈正相關(guān)（圖6A）。DRGS高分組（n = 183）的樣本TMB明顯高于DRGS低分組（n = 182）（圖6B）。所有的突變事件被分為不同的類別，其中錯義突變在變異分類中占最大比例（圖S2A，B），單核苷酸多態(tài)性（SNPs）的發(fā)生頻率遠遠高于插入或缺失，C>T是所有TCGA-STAD樣本中最常見的單核苷酸變異（SNV）。值得注意的是，DRGS高分組的每個樣本的變異中值（121）高于DRGS低分組（59.5）。此外，瀑布圖還顯示了每個樣本中前10個突變基因的突變事件。在DRGS高分組中，TTN的突變頻率最高（59%），其次是TP53（54%）和MUC16（39%，圖S2B）。在DRGS低分組中，突變頻率最高的基因是TP53（34%），其次是TTN（33%）和MUC16（21%，圖S2A）。

圖S2 TCGA-STAD 突變概述

????????PD-L1表達是對PD-L1阻斷易感性的另一個重要生物標(biāo)志物。發(fā)現(xiàn)DRGS高分組（n = 183）的PD-L1表達明顯高于DRGS低分組（n = 182）（圖6D）。DRGS得分與PD-L1表達呈正相關(guān)（圖6C）。

圖6 兩個DRGS評分組的分子特征

06、PD-L1阻斷劑的免疫治療在不同的15-DNA修復(fù)基因特征評分組中的益處

????????作者測試了DRGS評分系統(tǒng)預(yù)測患者對免疫療法反應(yīng)的能力，該分析基于IMvigor210CoreBiologies隊列（n = 348），研究PD-L1阻斷與atezolizumab在轉(zhuǎn)移性尿路上皮癌（mUC）中的臨床活性。發(fā)現(xiàn)DRGS高分患者（n = 174）表現(xiàn)出突出的總生存期延長（圖7A）。此外，該隊列中298名患者對抗PD-L1阻斷劑表現(xiàn)出不同程度的反應(yīng)，DRGS高分患者（n = 149）包括14.8%的完全反應(yīng)（CR），18.8%的部分反應(yīng)（PR），18.8%的穩(wěn)定疾?。⊿D）和47.6%的進展性疾?。≒D），而DRGS低分患者（n = 149）包括2.0%的CR，10.1%的PR，23.5%的SD和64.4%的PD。在DRGS高分組和低分組之間進行的Chi-squared檢驗也顯示，DRGS高分患者的治療效果明顯優(yōu)于低分患者（圖7B）。

????????作者還分析了兩組DRGS患者IMvigor210CoreBiologies的三種免疫亞型（免疫發(fā)炎、免疫排除和免疫沙漠）。DRGS高分患者（n = 142）包括33.1%發(fā)炎，45.8%排除和21.1%沙漠，而DRGS低分患者（n = 142）包括19.0%發(fā)炎，48.6%排除和32.4%沙漠。因此，與低分患者相比，DRGS高分患者的 "免疫發(fā)炎 "腫瘤比例明顯較高，而 "免疫沙漠 "和"免疫排除 "腫瘤的比例較低（圖7C）。

圖7 在兩個DRGS評分組中，PD-L1阻斷劑的免疫療法的好處

07、15-DNA修復(fù)基因特征得分及其潛在的化療價值

????????為了探索DRGS評分系統(tǒng)對化療中藥物反應(yīng)的影響，作者評估了DRGS評分與癌癥藥物敏感性基因組學(xué)（GDSC）數(shù)據(jù)庫中的胃癌細(xì)胞系（n = 23）對藥物反應(yīng)的關(guān)聯(lián)。確定了5個DRGS評分和藥物敏感性之間的顯著相關(guān)對，所有這些都顯示了與DRGS評分相關(guān)的耐藥性，包括胰島素樣生長因子受體IGF1R_3801，AKT抑制劑ipatasertib，生存抑制劑sepantronium bromide，ULK1蛋白激酶ULK1_4989和AKT抑制劑uprosertib（圖8A）。此外，發(fā)現(xiàn)這些藥物大多針對PI3K/MTOR、IGF1R和凋亡調(diào)節(jié)信號通路（圖8B）。

圖8 DRGS評分在化療中的潛在治療價值

08、免疫組化驗證15-DNA修復(fù)基因特征中的基因表達及與PD-L1表達的關(guān)系

????????通過IHC分析，發(fā)現(xiàn)在胃腫瘤組織中（n = 10），除PARPBP、EME1和RAD54L外，DRGS中大多數(shù)基因的蛋白表達都明顯增加（圖9A）。在HPA數(shù)據(jù)中，與正常組織相比，除了FANCA、UBE2T、POLQ、EXO1和XRCC2（它們沒有被包括在內(nèi)），DRGS的表達明顯上調(diào)（圖9B）。

圖9 胃癌組織和正常組織中DRGS基因的蛋白質(zhì)水平

????????作者還分析了DRGS和PD-L1蛋白表達之間的關(guān)系。如圖10A,B所示，根據(jù)IHC分析（n = 10），除PARPBP、EME1和RAD54L外，DRGS中的基因的蛋白表達與PD-L1表達呈正相關(guān)（圖10A,B）。在HPA數(shù)據(jù)中，PRKDC、FANCI、LIG1、RECQL4、FANCA、PARPBP、RAD54L和FANCD2（其余15個基因不包括在內(nèi)）的蛋白水平與PD-L1的蛋白水平呈正相關(guān)（圖10C）。

圖10 PD-L1和DRGS之間蛋白質(zhì)表達的相關(guān)性

四、結(jié)論

????????本研究開發(fā)了一種新的15-DNA修復(fù)基因特征（DRGS）及其相關(guān)評分系統(tǒng)，并評價了DRGS在鑒別胃腺癌患者不同分子和免疫特征及治療結(jié)果方面的效率。結(jié)果表明，與DRGS低分患者相比，DRGS高分患者對ICB的治療結(jié)果明顯更好。多組學(xué)數(shù)據(jù)綜合分析表明，DRGS評分高的患者具有抗腫瘤淋巴細(xì)胞浸潤水平高、腫瘤突變負(fù)荷（TMB）和PD-L1表達高等特征，與低評分患者相比，這些患者表現(xiàn)出更長的總生存期。DRGS是預(yù)測患者對基于免疫檢查點抑制劑（ICI）的治療反應(yīng)的一個有希望的指標(biāo)，需要進一步的研究來評估DRGS對于調(diào)整免疫療法的臨床效用。