Nature | 細胞間CRISPR篩查發(fā)現(xiàn)癌細胞吞噬調(diào)節(jié)因子

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撰文：huacishu

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1、研究表明APMAP的缺失與腫瘤抗原靶向單克隆抗體和阻斷CD47的單克隆抗體協(xié)同作用相關(guān)。

2、本研究利用巨噬細胞中的全基因組反篩選，發(fā)現(xiàn)G蛋白偶聯(lián)受體GPR84介導(dǎo)APMAP缺陷癌細胞的增強的吞噬作用。

3、這項工作揭示了一種對抗體驅(qū)動的吞噬作用敏感的癌癥內(nèi)在調(diào)節(jié)因子，擴展了人們對癌癥抵抗巨噬細胞吞噬作用機制的認識。

斯坦福大學(xué)醫(yī)學(xué)院Michael C. Bassik教授團隊在國際知名期刊Nature在線發(fā)表題為“Inter-cellular CRISPR screens reveal regulators of cancer cell phagocytosis”的研究論文。針對腫瘤抗原的單克隆抗體療法在很大程度上通過觸發(fā)巨噬細胞吞噬癌細胞來驅(qū)動癌細胞的清除。然而，癌細胞逃避吞噬作用的機制尚不完全清楚。本研究中作者開發(fā)了一個平臺，利用互補的全基因組CRISPR敲除在癌細胞和巨噬細胞中的過表達篩選，對阻礙抗體依賴性細胞吞噬（ADCP）的因素進行無偏差鑒定。在癌細胞中，除了CD47等已知因子外，還發(fā)現(xiàn)了許多對ADCP易感性的調(diào)節(jié)因子，包括脂肪細胞質(zhì)膜相關(guān)蛋白（APMAP）。作者發(fā)現(xiàn)，APMAP的缺失與腫瘤抗原靶向單克隆抗體和阻斷CD47的單克隆抗體協(xié)同作用相關(guān)，在廣泛的癌癥細胞類型中，包括那些對ADCP具有耐藥性的細胞，吞噬功能顯著增加。此外，APMAP缺失與幾種不同的腫瘤靶向單克隆抗體有協(xié)同作用，抑制小鼠腫瘤生長。利用巨噬細胞中的全基因組反篩選，發(fā)現(xiàn)G蛋白偶聯(lián)受體GPR84介導(dǎo)APMAP缺陷癌細胞的增強的吞噬作用。這項工作揭示了一種對抗體驅(qū)動的吞噬作用敏感的癌癥內(nèi)在調(diào)節(jié)因子，更廣泛地說，擴展了人們對癌癥抵抗巨噬細胞吞噬作用機制的認識。

為了確定ADCP的癌癥內(nèi)在調(diào)節(jié)因子，讓攜帶全基因組CRISPR敲除文庫的Ramos淋巴瘤細胞接受巨噬細胞的多輪抗體依賴性殺傷（圖1a）。該篩選中最敏感的基因包括編碼已知的抗吞噬因子CD47、CD47修飾酶QPCTL和幾種參與唾液酸合成的酶，已知這些酶可保護癌細胞免受先天性免疫細胞殺傷（圖1b），繼而驗證該篩選平臺識別ADCP調(diào)節(jié)器的能力。除了這些已知的調(diào)節(jié)因子外，還發(fā)現(xiàn)了許多以前與吞噬功能調(diào)節(jié)無關(guān)的基因，包括基因APMAP（圖1b）。接下來，使用CRISPR激活（CRISPRa）篩選來發(fā)現(xiàn)在Ramos細胞中未高水平內(nèi)源性表達的ADCP的其他調(diào)節(jié)因子（圖1c）。該篩選顯示了大量的抗吞噬命中和促吞噬命中（圖1d）基因。正如預(yù)期的那樣，CD20為強促吞噬作用因子（圖1d）。對CRISPRa篩選的抗吞噬細胞的基因本體富集分析，以及CRISPR敲除和CRISPRa篩選的抗吞噬細胞組合列表（圖1e），顯示參與唾液酸生物合成和蛋白質(zhì)唾液酸化的基因高度富集。值得注意的是，一些得分較高的基因是癌基因（GFI1和MUC12）、癌抗原（例如MUC1和LRRC15）、轉(zhuǎn)移驅(qū)動因素（例如MUC21、PODXL和SMAGP）或癌癥的陰性預(yù)后指標（例如C5AR1），但其在腫瘤發(fā)生中的作用尚不清楚，以前也未涉及吞噬功能的調(diào)節(jié)。通過培養(yǎng)弗羅多紅標記的Ramos CRISPRa細胞，表達針對每個基因的單導(dǎo)向RNA（SGRNA），并監(jiān)測靶細胞內(nèi)化和酸化后紅色熒光的時間依賴性增加，驗證了其中9個基因作為ADCP易感性的調(diào)節(jié)因子（圖1f）。對于SMAGP，它編碼一種特征很差的細胞表面糖蛋白，并且是CRISPRa篩選中最受歡迎的基因之一，在強EF1α啟動子下，F(xiàn)lag標記的SMAGP的表達足以保護Ramos細胞免受ADCP的侵襲。接下來，測試了Ramos CRISPRa篩選數(shù)據(jù)集是否可以用于預(yù)測基于其高表達的保護其他癌癥細胞系免受ADCP影響的基因。作者注意到SMAGP在結(jié)腸癌細胞中高水平表達。用以SMAGP為靶點的Cas9和sgRNAs轉(zhuǎn)導(dǎo)RKO細胞，發(fā)現(xiàn)SMAGP的缺失使RKO-Cas9細胞在存在抗CD47抗體的情況下對吞噬作用高度敏感（圖1g）。因此，CRISPRa篩選方法能夠識別僅在一部分細胞系中高水平表達的抗吞噬因子。為了確定受這些因子過度表達影響的抗體依賴性吞噬的階段，作者開發(fā)了一種基于成像的細胞粘附試驗，通過用細胞松弛素D抑制肌動蛋白聚合來評估在沒有吞噬的情況下的靶細胞結(jié)合（圖1h）。作者發(fā)現(xiàn)其中一個子集（包括編碼粘蛋白MUC1、MUC12和MUC21的基因）的過度表達阻止巨噬細胞在利妥昔單抗存在的情況下與Ramos靶細胞結(jié)合，這與報道的粘蛋白過度表達能夠封閉癌細胞表面的能力一致（圖1h）。大多數(shù)基因的過度表達也降低了兩種不同抗體—抗CD20和抗CD45與細胞表面的結(jié)合，而編碼轉(zhuǎn)錄阻遏物的GFI1的過度表達則降低了抗CD20結(jié)合。相比之下，包括SMAGP和ST6GALNAC1在內(nèi)的多個基因的過度表達并不影響靶細胞與巨噬細胞的結(jié)合或降低抗體結(jié)合（圖1h）。因此，篩選平臺確定了通過多種機制使癌癥逃避ADCP的基因。在Ramos CRISPR基因敲除篩查（圖1b）和使用抗CD30抗體在Karpas-299 T淋巴瘤細胞中進行的第二次全基因組ADCP篩查（圖1i）中，基因APMAP是吞噬敏感性最強的修飾因子之一，提示APMAP在腫瘤逃避吞噬作用中起重要作用。APMAP在人類組織類型和癌癥細胞系百科全書的所有細胞系中普遍表達，并在幾種惡性腫瘤中過度表達。在個體試驗中，在抗CD20和人巨噬細胞存在的情況下，APMAP敲除（APMAPKO）Ramos細胞對ADCP顯著致敏，甚至比CD47敲除（CD47KO）細胞更敏感（圖1j）。

與CD47KO細胞不同，在沒有抗體的情況下，APMAPKO?Ramos細胞不比SafeKO對照細胞更容易被吞噬（圖2a，b）。進一步測試了APMAP是否會增強CD47阻斷的效果。事實上，在兩個富含膜蛋白的約3100個基因的子文庫的篩選中，APMAP是最受歡迎的，其目的是識別當CD47被刪除或阻斷時，進一步使細胞對ADCP敏感的基因。此外，在Karpas-299細胞中抗CD47抗體驅(qū)動的全基因組吞噬敏感性篩查中，APMAP是最受歡迎的（圖2c）。在定量活細胞成像實驗中，APMAP缺陷的Ramos細胞在CD47阻斷抗體存在時比使用J774巨噬細胞（圖2d）或原代人類巨噬細胞的對照細胞對吞噬作用更敏感。APMAP缺失也增強了聯(lián)合抗CD20和抗CD47治療誘導(dǎo)的ADCP（圖2e）。在一系列實驗中，證實了APMAP缺失特異性地使癌細胞對吞噬作用敏感，而不影響已知促吞噬或抗吞噬信號的表達、腫瘤靶向抗體的結(jié)合或?qū)σ唤M其他細胞毒性藥物的敏感性。APMAP包含一個短胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域、一個跨膜結(jié)構(gòu)域和一個預(yù)測的細胞外或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)腔結(jié)構(gòu)域（圖2f）。為了評估每個結(jié)構(gòu)域?qū)PMAP在保護癌細胞免受吞噬方面的作用的貢獻，用編碼一系列標記的APMAP等位基因的構(gòu)建物轉(zhuǎn)導(dǎo)APMAPKO-Ramos細胞。標記為野生型的全長APMAP恢復(fù)了APMAPKO?Ramos細胞抑制吞噬的能力（圖2g）。相比之下，基于PON1的同源性（圖2f），預(yù)計催化所需的預(yù)測鈣結(jié)合殘基的突變消除了ADCP中的APMAP功能（圖2g）。盡管如此，該突變體表現(xiàn)出與野生型APMAP相似的表達水平和定位模式。因此，預(yù)測的催化活性APMAP包含在其內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)腔或胞外結(jié)構(gòu)域中，是抑制吞噬作用所必需的。

為了研究APMAP在保護癌細胞免受吞噬作用中的作用是否在其他腫瘤類型中保持不變，檢測了來自不同譜系的八種癌細胞系的吞噬敏感性，其中每種細胞系均以中等水平表達APMAP和CD47。對于每一種細胞系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)靶向sgRNAs的APMAP的表達大大增強了細胞對抗CD47驅(qū)動的吞噬作用的敏感性（圖3a）。在四個小鼠模型中檢測了APMAP丟失對腫瘤生長的影響。在前兩個模型中，將Ramos淋巴瘤或NCI-H82小細胞肺癌細胞注射到缺乏適應(yīng)性免疫細胞但含有功能性巨噬細胞的NSG小鼠。用CD47阻斷抗體或磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）對照治療小鼠（圖3b）。正如預(yù)期的那樣，CD47阻斷抑制了Ramos和NCI-H82（圖3b）腫瘤的發(fā)展。值得注意的是，APMAP缺乏增強了CD47阻斷劑對兩種腫瘤生長的抑制作用，但在沒有CD47阻斷劑的情況下沒有效果（圖3b）。在第三個模型中發(fā)現(xiàn)APMAP丟失既增加了巨噬細胞浸潤，又增強了利妥昔單抗對Ramos腫瘤的作用（圖3c）。最后，將小鼠B16-F10黑色素瘤細胞注射到同基因C57BL/6小鼠體內(nèi)，并用抗TRP1腫瘤靶向抗體治療。缺乏APMAP的腫瘤對抗TRP1治療顯著敏感。因此，盡管需要進一步的研究來評估靶向APMAP的治療潛力，但這些實驗表明，APMAP缺失增強了多種腫瘤靶向抗體對小鼠腫瘤生長的抑制作用。

假設(shè)APMAP缺失通過巨噬細胞受體調(diào)節(jié)吞噬信號，從而增強癌細胞的攝取。為了確定候選受體，作者進行了基于互補熒光激活細胞分類（FACS）的篩選，這次是利用巨噬細胞中的CRISPR敲除文庫，并使用癌細胞作為吞噬靶細胞來確定ADCP的一般調(diào)節(jié)因子。在將全基因組敲除巨噬細胞與APMAPKO-Ramos細胞孵育后，分離吞噬每種靶細胞類型的巨噬細胞（圖4a）。我們對每個分類群體中的sgRNAs進行了深度測序，并進行了兩個關(guān)鍵的比較。首先，通過比較雙陰性群體，確定了攝取APMAPKO細胞所需的基因，其中包括吞噬所需的關(guān)鍵肌動蛋白調(diào)節(jié)因子和信號因子（圖4b）。其次，我們比較了兩個單一陽性群體，以確定攝取APMAPKO細胞所需的選擇性基因。該分析揭示了APMAPKO細胞吞噬作用所需的兩個特定基因：GPR84和GNB2（圖4c）。使用延時成像分析驗證了GPR84對于增強APMAPKO細胞的ADCP是必需的；GPR84的缺失消除了人或小鼠巨噬細胞對APMAPKO細胞的增強攝取，但并未減少對SafeKO細胞或CD47KO細胞的攝取（圖4d）。在已經(jīng)缺乏GPR84的細胞中，GNB2或PREX1的缺失僅略微降低了APMAP敲除細胞的ADCP，這與它們在GPR84共同途徑中的功能一致。使用中鏈脂肪酸或兩種合成激動劑（ZQ-16和6-OAU）刺激GPR84，刺激SafeKO細胞的抗體依賴性吞噬（圖4e），但不刺激APMAPKO細胞?？傊?，從化學(xué)和遺傳分析揭示了G蛋白偶聯(lián)受體信號在APMAP缺陷靶細胞ADCP增強中的作用。

單克隆抗體療法被描述為癌癥治療中的“魔彈”，因為原則上，它們可以通過巨噬細胞自定義清除癌細胞，而巨噬細胞在大多數(shù)腫瘤中都很豐富。然而，腫瘤微環(huán)境中巨噬細胞的吞噬活性低下以及癌細胞表達抗吞噬因子仍然是實現(xiàn)單克隆抗體治療在多種癌癥治療中的應(yīng)用前景的關(guān)鍵障礙。本研究中作者開發(fā)了一種功能基因組學(xué)方法，通過在癌細胞和巨噬細胞中進行ADCP調(diào)節(jié)因子的互補全基因組篩查來研究腫瘤與巨噬細胞的相互作用。研究發(fā)現(xiàn)了大量增強或抑制ADCP的基因，這有助于闡明巨噬細胞與腫瘤相互作用的基本生物學(xué)，并可能有助于確定新的潛在治療靶點。

教授介紹

Michael C. Bassik教授來自斯坦福大學(xué)醫(yī)學(xué)院，他的實驗室利用哺乳動物細胞中高度復(fù)雜的shRNA文庫和系統(tǒng)遺傳相互作用圖來了解內(nèi)吞病原體的生物學(xué)以及細胞死亡機制的應(yīng)激信號。他們還開發(fā)了新的工具來進行基因篩選和生成相互作用圖，對包括糖尿病在內(nèi)的健康和疾病狀態(tài)下的基因組進行功能闡釋。創(chuàng)建了全基因組CRISPR/Cas9 sgRNA文庫，并將其與shRNA文庫并行使用，成功地進行了約150次全基因組篩選。以通訊作者在Nature, Nat Genet, neuron雜志上發(fā)表論文多篇。

參考文獻

Kamber RA, Nishiga Y, Morton B, et al. Inter-cellular CRISPR screens revealregulators of cancer cell phagocytosis. Nature.2021;10.1038/s41586-021-03879-4. doi:10.1038/s41586-021-03879-4