DNA的甲基化一般是抑制DNA表達(dá)的，即基因的甲基化水平越高，表達(dá)水平則越低，精子和大多數(shù)體細(xì)胞都符合這種模式。然而在卵細(xì)胞基因組中，許多轉(zhuǎn)錄惰性區(qū)呈現(xiàn)低甲基化特征。這種獨(dú)特的甲基化模式是怎么形成的，對早期胚胎的發(fā)育潛能有什么影響還不清楚。

2018年11月28日中國科學(xué)院生物物理研究所的朱冰研究員團(tuán)隊(duì)在Nature雜志上發(fā)表了名為Stella safeguards the oocyte methylome by preventing de novo methylation mediated by DNMT1的研究成果，發(fā)現(xiàn)Stella通過引導(dǎo)UHRF1出核，抑制UHRF1和DNMT1介導(dǎo)的卵細(xì)胞基因組甲基化；敲除Stella則會(huì)引起卵細(xì)胞基因組高甲基化，進(jìn)而影響合子基因組激活和胚胎植入前的發(fā)育。

下面我們一起來精讀這篇文獻(xiàn)吧，只想學(xué)習(xí)作者套路的童鞋可直接滑到最后查看文末的學(xué)霸筆記。

背景介紹

DNA甲基化

DNA甲基化是指在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferases, DNMTs）作用下，DNA胞嘧啶（C）的第5位碳原子獲得一個(gè)甲基，轉(zhuǎn)變?yōu)?-甲基胞嘧啶（5-mC）。DNMTs主要分為兩類，即維持性DNA甲基轉(zhuǎn)移酶和從頭甲基化酶，前者主要指DNMT1，使DNA在復(fù)制過程中能將母鏈的甲基化模式穩(wěn)定遺傳給子鏈，后者包括DNMT3A、DNMT3B和DNMT3L，能將未甲基化或低甲基化的區(qū)域甲基化。DNMT3L自身并沒有DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性，主要是增強(qiáng)DNMT3A和DNMT3B的酶活性。

Stella

Stella又名Dppa3（developmental pluripotency-associated 3）或PGC7（primordial germ cell 7），主要表達(dá)于原始生殖細(xì)胞（primordial germ cell, PGC）、植入前胚胎和其他多能干細(xì)胞，在早期胚胎發(fā)育和多能性維持中有重要作用。Stella對雌性的生殖能力很重要，既往研究顯示，Stella缺陷的雌性小鼠受精后產(chǎn)生的胚胎多停滯在植入前階段，很少能達(dá)到囊胚期。Stella還能夠抑制Tet3介導(dǎo)的DNA去甲基化，從而維持母源基因組的甲基化狀態(tài)。

Uhrf1

Uhrf1（ubiquitin like with PHD and ring finger domains 1）一個(gè)多功能的表觀遺傳調(diào)控因子，參與調(diào)控DNA甲基化和多種組蛋白翻譯后修飾。DNMT1是一種自我抑制性甲基轉(zhuǎn)移酶，受UHRF1調(diào)控。UHRF1能夠特異性地識別和結(jié)合半甲基化的DNA鏈，并招募DNMT1至DNA鏈，解除DNMT1的自我抑制性，對新生子鏈進(jìn)行甲基化。

合子基因組激活

哺乳動(dòng)物生殖細(xì)胞在減數(shù)分裂過程中和受精后形成的早期胚胎中，其基因組是轉(zhuǎn)錄靜止的，直到受精卵分裂幾次后，其基因組才開始轉(zhuǎn)錄，表達(dá)新的基因，這一事件叫做合子基因組激活（zygotic genome activation, ZGA）。ZGA之前，胚胎的發(fā)育主要由母源因子調(diào)控。

方法與結(jié)果

1 Stella通過出核信號引導(dǎo)Uhrf1出核

作者在體細(xì)胞中過表達(dá)Stella，發(fā)現(xiàn)能引起DNA去甲基化，同時(shí)發(fā)現(xiàn)Stella與Uhrf1存在相互作用。考慮到Stella和Uhrf1在卵細(xì)胞發(fā)生過程中都高表達(dá)，作者就想在小鼠卵細(xì)胞中探究一下Stella是否調(diào)控Uhrf1。

在D5~D15的正常對照卵細(xì)胞中（Stella+/-，因?yàn)槁鸭?xì)胞是單倍體，所以半合子就是正常狀態(tài)），Stella均勻分布，Uhrf1主要分布于細(xì)胞質(zhì)中，而敲除Stella后，Uhrf1主要分布于細(xì)胞核，直到D20才出現(xiàn)在細(xì)胞質(zhì)中，但細(xì)胞核中一直存在。在HEK293細(xì)胞中過表達(dá)Stella，能使UHRF1主要分布于細(xì)胞質(zhì)。

以上說明Stella能夠引導(dǎo)Uhrf1出核，那么Stella是如何引導(dǎo)Uhrf1出核的呢？

作者用輸出蛋白特異性的抑制劑LMB（leptomycin B）處理過表達(dá)Stella的HEK293細(xì)胞，能夠阻止Stella引導(dǎo)的Uhrf1出核，使Uhrf1主要分布于細(xì)胞核。過表達(dá)出核信號序列突變的Stella（Stella(NESmut)）同樣不能引導(dǎo)Uhrf1出核，盡管Stella(NESmut)與Uhrf1仍存在相互作用。由此說明Stella主要通過出核信號引導(dǎo)Uhrf1出核。

此外，作者過表達(dá)一種與Uhrf1親和力減退但出核信號正常的Stella(KRR)突變體(K85E/R86E/R87E)，可引導(dǎo)部分Uhrf1出核，細(xì)胞核內(nèi)仍有Uhrf1殘留，提示Stella引導(dǎo)Uhrf1出核需要Stella與Uhrf1相互作用。

此圖為原文Fig. 1。圖a-b分別顯示正常對照Stella+/?和敲除Stella（Stella?/?）的卵細(xì)胞中，卵子發(fā)育過程中Stella和UHRF1的細(xì)胞定位變化，c圖是a-b圖的定量。圖d顯示在穩(wěn)轉(zhuǎn)GFP-UHRF1的HEK293細(xì)胞中慢病毒轉(zhuǎn)染不同形式的Stella或輸出蛋白抑制劑LMB，對UHRF1亞細(xì)胞定位的影響。

2 Stella通過Uhrf1阻止卵巢基因組過度甲基化

第一部分證明了Stella能夠引導(dǎo)Uhrf1出核，那么出核的意義是什么呢？

考慮到Uhrf1參與調(diào)控DNA甲基化，作者對不同階段的卵細(xì)胞進(jìn)行甲基化檢測，發(fā)現(xiàn)Stella?/? MⅡ卵細(xì)胞的總體甲基化水平增加了2倍。異常高甲基化區(qū)域主要位于各種類型的重復(fù)序列和發(fā)育相關(guān)基因，印記基因的甲基化水平未發(fā)生明顯變化。

選擇一些獨(dú)特的100bp片段，若其在D5卵細(xì)胞的甲基化水平<25%，而在MⅡ卵細(xì)胞的甲基化水平>75%，則定義為卵子發(fā)生獲得的甲基化區(qū)域（oogenesis-acquired methylated regions, ooAMRs）。在正常對照卵細(xì)胞中，這些ooAMRs稱為normal ooAMRs，有28661個(gè)。敲除Stella后，這些normal ooAMRs大多（96.5%）能正常建立，除此之外，作者還發(fā)現(xiàn)了28122個(gè)extra ooAMRs。

在Uhrf1和Stella雙敲除的卵細(xì)胞中，那些extra ooAMRs完全消失，其甲基化譜與Uhrf1單敲除的MⅡ卵細(xì)胞相似，提示Stella?/? MⅡ卵細(xì)胞的異常高甲基化是由Uhrf1介導(dǎo)的。

那么Stella?/? MⅡ卵細(xì)胞的異常高甲基化對卵細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)錄和胚胎發(fā)育有沒有影響呢？

Stella?/? MⅡ卵細(xì)胞的異常高甲基化對基因組轉(zhuǎn)錄只產(chǎn)生輕度影響，大多數(shù)啟動(dòng)子區(qū)或CpG島（CpG islands, CGIs）異常高甲基化的基因在對照組卵細(xì)胞中已處于沉默狀態(tài)，而Stella?/? MⅡ卵細(xì)胞的異常高甲基化偏好發(fā)生于失活基因的啟動(dòng)子區(qū)和CGIs。

作者構(gòu)建了Stella和Uhrf1分別單敲或雙敲的卵細(xì)胞，觀察其受精后胚胎發(fā)育情況（Fig. 2d），發(fā)現(xiàn)Stella單敲除的胚胎發(fā)育到囊胚期的比例最低，其次是Stella和Uhrf1雙敲除。

此圖為原文Fig. 2。圖a顯示敲除Stella或Stella和Uhrf1雙敲除對不同階段的卵細(xì)胞總體甲基化的影響，圖b顯示的是對CpG島甲基化的影響。圖c顯示的是Stella和Uhrf1分別單敲除或雙敲除normal ooAMRs和extra ooAMRs的變化熱圖。圖d顯示的是Stella和Uhrf1分別單敲除或雙敲除對胚胎發(fā)育的影響。圖e顯示的是的Stella?/?卵細(xì)胞相對于對照的啟動(dòng)子甲基化水平與平均基因表達(dá)水平的散點(diǎn)圖。

3 Stella缺陷對受精卵和胚胎發(fā)育的影響

Stella?/? MⅡ卵細(xì)胞的異常高甲基化對卵細(xì)胞基因表達(dá)只有輕度影響，那它對受精卵的基因轉(zhuǎn)錄，尤其是合子基因組激活有無影響呢？

我們知道，受精卵發(fā)育初期會(huì)發(fā)生大規(guī)模甲基化擦除，去除雙親的甲基化記憶，然后重新建立甲基化，于是作者首先探究了Stella?/? MⅡ卵細(xì)胞的異常高甲基化能否在這一輪甲基化擦除活動(dòng)中幸免。

作者比較了Stella+/+和Stella△m/+受精卵雌原核的normal ooAMRs和extra ooAMRs的相對去甲基化水平（relative demethylation level, RDL）,發(fā)現(xiàn)normal ooAMRs的RDL無明顯差異，而extra ooAMRs有相當(dāng)一部分沒有去甲基化（Fig. 3a）。作者同時(shí)觀察了Stella+/+和Stella△m/+受精卵雄原核的總體RDL水平，發(fā)現(xiàn)Stella△m/+受精卵雄原核的RDL水平降低，推測是由雌原核的高甲基化競爭去甲基化酶所致，UHPLC–MS/MS檢測發(fā)現(xiàn)雄原核5hmC水平降低證明了這一推測。UHPLC–MS/MS同時(shí)檢測了受精卵總體的5mC和5hmC水平，發(fā)現(xiàn)Stella△m/+受精卵總體的5mC和5hmC水平增加（Fig. 3c）。

作者接下來檢測了Stella?/? MⅡ卵細(xì)胞從MⅡ階段到受精形成的雌原核和兩細(xì)胞胚胎階段，normal ooAMRs和extra ooAMRs的CG甲基化變化，發(fā)現(xiàn)這一過程中Stella?/?卵細(xì)胞的normal ooAMRs甲基化無明顯變化，extra ooAMRs的甲基化水平明顯升高（Fig. 3d）。

對兩細(xì)胞胚胎進(jìn)行RNA-seq，發(fā)現(xiàn)Stella△m/+兩細(xì)胞胚胎的基因表達(dá)明顯下調(diào)。作者著重觀察了合子基因組激活（ZGA）基因，即只有12個(gè)ZGA基因能正常激活，167個(gè)ZGA基因表達(dá)下調(diào)（Fig. 3e），且ZGA缺陷基因的甲基化水平明顯升高（Fig. 3f）。

為了確定Stella?/? MⅡ卵細(xì)胞對基因表達(dá)和胚胎發(fā)育的影響是由細(xì)胞核還是細(xì)胞質(zhì)所致，作者進(jìn)行了紡錘體移植實(shí)驗(yàn)（Fig. 3g），發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)同時(shí)敲除對ZGA基因表達(dá)和胚胎發(fā)育的影響最大，其次是細(xì)胞質(zhì)敲除，再次是細(xì)胞核敲除（Fig. 3h-i），但細(xì)胞核敲除的ZGA缺陷基因甲基化程度高于細(xì)胞質(zhì)敲除（原文Extended Fig. 7d）。

此圖為原文Fig. 3。圖a是受精卵雌原核normal ooAMRs和extra ooAMRs的RDL變化，RDL>0即說明有發(fā)生去甲基化。圖b是受精后11-12h收集的雌、雄原核和受精后28h收集的兩細(xì)胞胚胎的甲基化水平。圖c是UHPLC–MS/MS檢測受精后14h的受精卵（去除了極體）的5mC和5hmC水平。圖d是卵細(xì)胞從MⅡ到受精和兩細(xì)胞（2C）胚胎階段，normal ooAMRs和extra ooAMRs的CG甲基化變化。圖e是Stella△m/+和正常對照兩細(xì)胞胚胎的基因表達(dá)變化，紅色代表上調(diào)2倍的ZGA基因，綠色代表下調(diào)2倍的ZGA基因。圖f分析ZGA缺陷基因、ZGA正?；蚝推渌黌GA基因的啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平。圖g是紡錘體移植圖解。圖h分析紡錘體移植后受精的兩細(xì)胞胚胎ZGA缺陷基因的表達(dá)。圖i顯示紡錘體移植后受精的胚胎發(fā)育情況。

4 Stella敲除后的異常甲基化依賴DNMT1

背景介紹中提到甲基化轉(zhuǎn)移酶主要有3種，那么Stella?/? MⅡ卵細(xì)胞的異常甲基化是哪一個(gè)酶催化的呢？

作者用免疫熒光檢測了正常對照和Stella?/?卵細(xì)胞中DNMT1、DNMT3A、DNMT3B的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在對照和Stella?/?卵細(xì)胞中DNMT3B根本檢測不出來，DNMT3As亞細(xì)胞定位無明顯變化，DNMT1在對照卵細(xì)胞中主要定位于細(xì)胞質(zhì)，而敲除Stella后，DNMT1在中心體周圍有點(diǎn)狀分布（Fig. 4a-b），Uhrf1在此位置也有分布，而敲除Uhrf1后，DNMT1不再在中心體周圍分布（Fig. 4c），提示DNMT1在中心體周圍的分布呈Uhrf1依賴性。同時(shí)作者觀察到敲除Stella后，卵子發(fā)育過程中主要衛(wèi)星重復(fù)序列的甲基化水平明顯增加（Fig. 4d）。

為了明確DNMT1和DNMT3A中究竟是哪一個(gè)負(fù)責(zé)Stella?/?卵細(xì)胞的異常甲基化，作者分別構(gòu)建了Dnmt1和Dnmt3a敲除的卵細(xì)胞，進(jìn)行甲基化檢測，發(fā)現(xiàn)敲除Dnmt1能明顯降低Stella?/?卵細(xì)胞的甲基化水平，而敲除Dnmt3a對其無明顯影響（Fig. 4e），說明Stella?/?卵細(xì)胞的異常甲基化主要依賴于DNMT1。

此圖為原文Fig. 4。圖a-b分別顯示Stella+/?和Stella?/?卵細(xì)胞UHRF1和DNMT1的亞細(xì)胞定位。圖c的DKO指的是double knock out，即Stella和Uhrf1同時(shí)敲除。圖d顯示敲除Stella后卵子發(fā)育過程中主要衛(wèi)星重復(fù)序列的甲基化變化。圖e顯示相應(yīng)基因型甲基化水平的聚類分析。

結(jié)論

敲除Stella能使卵細(xì)胞的UHRF1和DNMT1異常聚積于核內(nèi)，對卵細(xì)胞基因組進(jìn)行重新甲基化，影響合子基因組激活和胚胎植入前的發(fā)育。卵細(xì)胞正常表達(dá)的Stella能夠通過出核信號引導(dǎo)UHRF1出核，避免UHRF1和DNMT1對卵細(xì)胞基因組進(jìn)行過度甲基化。

學(xué)霸筆記

套路分析

這篇文章作者觀察到敲除Stella能使卵細(xì)胞的UHRF1發(fā)生異位，然后探究此現(xiàn)象的意義。因?yàn)閁HRF1能夠調(diào)控DNA的甲基化，作者便從DNA的甲基化著手，發(fā)現(xiàn)敲除Stella能引起卵細(xì)胞基因組的異常甲基化，并且此異常甲基化依賴于UHRF1。DNA甲基化可以影響DNA表達(dá)水平，所以作者同時(shí)檢測了它對卵細(xì)胞基因組表達(dá)的影響。

高甲基化的卵細(xì)胞受精后會(huì)不會(huì)對受精卵和胚胎發(fā)育產(chǎn)生影響呢？于是作者檢測了Stella?/?卵細(xì)胞對受精卵甲基化擦除、合子基因組激活和胚胎發(fā)育的影響，并通過紡錘體移植實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步明確到底是細(xì)胞核還是細(xì)胞質(zhì)缺陷造成的這些影響。

Stella?/?卵細(xì)胞基因組的異常甲基化是哪一個(gè)甲基轉(zhuǎn)移酶催化的呢？作者通過分別敲除Dnmt1和Dnmt3a，明確了Stella?/?卵細(xì)胞基因組的異常甲基化由Dnmt1催化，并依賴于UHRF1。

閃光點(diǎn)與不足

這篇文章的閃光點(diǎn)我覺得主要在于兩方面，一是揭示了卵細(xì)胞基因組低甲基化的原因，二是發(fā)現(xiàn)維持性甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT1也有重新甲基化的作用。

不足之處，原文討論中也有提及，就是DNMT1的重新甲基化作用究竟是對DNMT3A催化的半甲基化的CpG島進(jìn)行甲基化還是完全自己重新甲基化，文章沒有明確證明，雖然作者根據(jù)已有證據(jù)傾向于后者。

對學(xué)霸的啟發(fā)

這篇文章用的是反證法，通過把Stella敲除出現(xiàn)的一系列異常，證明Stella的作用，感覺挺繞的，學(xué)霸看的很痛苦，一開始根本看不懂（充分說明了功力不夠），不過看懂之后的成就感也是大大的。

暫時(shí)還沒想到如何跟自己的課題結(jié)合起來，不過倒是提醒自己，不要拘泥于已有的概念，如本文正因?yàn)橥黄屏薉NMT1維持性甲基轉(zhuǎn)移酶的傳統(tǒng)觀點(diǎn)，所以才更顯突出吧。

希望本文能給你以啟發(fā)。