Evolutionary conservation analysis of human arachidonic acid metabolism pathway genes
1. Levels of sEH and Eicosanoid Metabolites Altered in Myocarditis
作者首先使用了靶向LC-MS/MS檢測了心肌炎患者樣本中 eicosanoids（包括環(huán)氧酶 COX, 脂氧酶 LOX 和 CYP 通路的代謝物的變化，也就是上圖）結(jié)果顯示EET是變化最顯著的(a)，出現(xiàn)了顯著下降(b)。而DHET/EET ratio則顯著上調(diào)，提示sEH的活性上調(diào)(c)。在心肌炎小鼠樣本中也得到了一致的結(jié)果（d-f）。在心肌炎患者心臟樣本中，sEH蛋白表達顯著升高(g)。在心肌炎小鼠樣本中也是一樣，造模后3天小鼠心臟中sEH水平即升高，并主要是在心肌和成纖維中表達(h-k)。
2. sEH Inhibition Prevents Cardiac Dysfunction of CVB3-Induced Myocarditis by Promoting an Antiviral Response
為了確定EETs是否可以阻斷心肌炎的進展，作者使用sEH抑制劑TPPU對心肌炎小鼠進行了治療。結(jié)果顯示心肌炎小鼠心功能改善，心臟炎癥浸潤程度減輕，巨噬細胞、T細胞、中性粒細胞浸潤減少。心臟促炎因子的表達下降，而干擾素的表達上升，心臟病毒含量也下降。Implying that the increased production of IFNs in sEH inhibitor–treated mice prevented viral replication.
為了更好的模擬臨床情況，作者在給予CVB3后第3天開始給予TPPU，持續(xù)到4w。結(jié)果也顯示了很好的治療效果。
3. 14,15-EET Positively Regulates Type I IFN Production
隨后，作者使用CVB3干預了原代心肌細胞和成纖維細胞。結(jié)果顯示干預12h后，sEH蛋白表達在兩種細胞中都顯著上調(diào)。而sEH抑制劑減輕了CVB3干預后的病毒復制。在EET中，最顯著改變的是14,15-EET，而14,15-EET 的 antagonist 14,15-epoxyeicosa- 5(Z)-enoic acid (EEZE; 1 μM) 抵消了TPPU的保護作用。
此外，和體內(nèi)實驗結(jié)果一致，CVB3可以誘導I型和II型干擾素的表達，而抑制 sEH 則以EEZE-sensitive manner增加了IFN-α 和 IFN-β的表達。其中IFN-β的變化更為顯著。IFN-β調(diào)節(jié)蛋白ISG15 和 CXCL10的表達也同樣sensitive to sEH inhibition and 14,15-EET。同樣的， sEH inhibition 和14,15-EET 的功能 were sensitive to the EET antagonist。
阻斷IFNAR則消除了sEH inhibition 和 14,15-EET的保護作用。Thus, the antiviral actions linked to sEH inhibition seem to be linked to 14,15-EET–dependent effects on IFN expres- sion and IFNAR activation.
4. EETs Enhanced Type I IFN Signaling After CVB3 Infection by Targeting TBK1
由于IRF3在病毒感染時誘導I型干擾素表達中發(fā)揮著重要作用，因此作者探究了14,15EET和IRF3活化間的潛在關(guān)系。結(jié)果顯示，CVB3感染的AC16細胞引起IRF3 Ser396位點的磷酸化，IRF3dimer形成增加和核轉(zhuǎn)位增加(a-d)。14,15EET（以及11,12EET）干預AC16也得到了一致的結(jié)果。
CVB3激活I(lǐng)RF3的主要途徑包括e圖中的兩條（下圖的左部分，漏掉了cGAS）。
Nucleic Acid Sensors as Therapeutic Targets for Human Disease
si掉MDA5顯著下調(diào)了CVB3和EET誘導IRF3磷酸化的能力(f)，而si掉TLR3則沒有得到類似的效果(g)。隨后作者進行了熒光報告基因?qū)嶒灐ｏ@示過表達MDA5, MAVS, TBK1和IRF3-5D都可以增強熒光素酶IFNB活性，而且EETs可以在過表達MDA5, MAVS, 和 TBK1的細胞中顯著增強熒光素酶活性，但是在過表達 IRF3- 5D mutant中則沒有(h)。另一方面，reduced IRF3 phosphorylation in response to CVB3 and abrogated the effects of the sEH inhibitor and EETs(I)。 Overall, these findings suggest that EETs are able to promote type I IFN signaling by targeting TBK1.
5. EETs Positively Regulated TBK1 Activation via Enhancing the Interaction Between GSK3β and TBK1
接著，作者探究了14,15-EET 和 11,12-EET 是怎樣增加TBK1的活化并調(diào)控 type I IFN 通路的。使用CVB3感染、TPPU干預、EET干預都不影響TBBK1的表達，EET干預后的AC16也不存在TBK1磷酸化增加，提示存在著其他調(diào)控機制。隨后，作者使用了IP-MS檢測了與TBK1結(jié)合的蛋白。結(jié)合磷酸化質(zhì)譜數(shù)據(jù)，鑒定出GSK3β與TBK1相互作用，并且在11,12-EET and 14,15-EET刺激后的AC16中其磷酸化增加。
si掉GSK3b后，CVB3和EET誘導的IRF3活化減低(a)。而且CVB3誘導的IRF3 磷酸化并沒有受到影響，提示EETs 的功能依賴于這個激酶的表達。而且CVB3干預后AC16的GSK3b磷酸化增加，EET刺激后，其磷酸化也增加(b)。此外，14,15-EET 在CVB3感染后增強了GSK3β 和 TBK1 的互作(c)。因此，作者通過replacing Tyr216 with aspartate (Y216D) or phenylalanine (Y216F)構(gòu)建了GSK3β的 nonphosphorylatable 和 phosphomimetic 突變體，結(jié)果顯示在病毒感染后的細胞中，Y216D mutant 誘導了了的TBK1磷酸化(d)。Con- sistent with these observations, 14,15-EET increased TBK1 phosphorylation in CVB3-infected cells express- ing the wild-type GSK3β but not in cells expressing the nonphosphorylatable GSK3β mutant(e, f)。
Thus, in the course of CVB3 infection, EETs are able to positively regulate TBK1 activity by eliciting the phos- phorylation of GSK3β to enhance its interaction with
TBK1.
隨后，作者構(gòu)建了心肌細胞特異性sEH敲除的小鼠。結(jié)果顯示敲除鼠給予CVB3后其心功能改善，心臟炎癥減輕，TBK1和GCSK3B表達和磷酸化均增加。
最后，作者探究了是否抑制GSK3β可以影響EET的保護作用(a)，結(jié)果顯示給予了AAV9-U6-shGSK3B的小鼠顯著降低了心臟GSK3β的表達(b)，并阻斷了EET的保護效應(yīng)(c,d)。給予GSK3β抑制劑也得到了一致的結(jié)果(e-g)。同時 GSK3β 抑制劑降低了sEHiΔMyh6心肌細胞中TBK1 和 GSK3β 的磷酸化。Collectively, these data indicate that EETs exert a cardioprotective effect during CVB3 infection through a GSK3β-dependent signaling cascade involving the type I IFN pathway.
