細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)
細(xì)胞增殖、凋亡及細(xì)胞周期調(diào)控，是腫瘤學(xué)研究中的核心表型指標(biāo)，同時(shí)也是分子生物學(xué)與藥理學(xué)領(lǐng)域的重點(diǎn)研究方向。在實(shí)驗(yàn)研究中，研究者通常通過在細(xì)胞內(nèi)實(shí)現(xiàn)特定基因的過表達(dá)或干擾，來探究該基因?qū)?xì)胞增殖的調(diào)控作用，進(jìn)而深入解析基因功能；此外，也可通過對(duì)細(xì)胞進(jìn)行藥物干預(yù)，明確藥物對(duì)細(xì)胞增殖活性的影響機(jī)制。
作為生物體最基本的生命特征之一，細(xì)胞增殖通過細(xì)胞分裂實(shí)現(xiàn)數(shù)量增長，是機(jī)體生長、發(fā)育、繁殖及遺傳的基礎(chǔ)。目前，用于研究細(xì)胞增殖的實(shí)驗(yàn)方法較為豐富，其中CCK8、CellTiter-Glo?（CTG）及MTT實(shí)驗(yàn)是最為常用的幾種。
（1）CCK-8實(shí)驗(yàn)
Cell Counting Kit-8（簡(jiǎn)稱CCK-8）試劑，可快速、簡(jiǎn)便且精準(zhǔn)地用于細(xì)胞增殖能力及毒性的檢測(cè)分析。該實(shí)驗(yàn)的核心目的，是探究目的基因或藥物對(duì)細(xì)胞增殖能力的具體影響。
實(shí)驗(yàn)步驟：細(xì)胞收集→細(xì)胞鋪板→（按需進(jìn)行藥物處理）→將細(xì)胞分別培養(yǎng)0、6、24、48、72小時(shí)后，加入CCK-8試劑進(jìn)行處理，最終通過酶標(biāo)儀檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果：（根據(jù)酶標(biāo)儀檢測(cè)數(shù)據(jù)，分析不同組別細(xì)胞增殖活性的差異，明確目的基因或藥物對(duì)細(xì)胞增殖的促進(jìn)或抑制作用）
（2）CTG實(shí)驗(yàn)
與CCK-8實(shí)驗(yàn)類似，CTG實(shí)驗(yàn)（CellTiter-Glo?實(shí)驗(yàn)）的核心目的也是探究目的基因或藥物對(duì)細(xì)胞增殖能力的調(diào)控作用，適用于大規(guī)模、高靈敏度的增殖檢測(cè)。
實(shí)驗(yàn)步驟：細(xì)胞收集→細(xì)胞鋪板→（按需進(jìn)行藥物處理）→將細(xì)胞分別培養(yǎng)0、24、48、72、96小時(shí)后，加入CellTiter-Glo?溶液，用微孔板震蕩器震蕩5分鐘，室溫放置10分鐘后，通過酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光值。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果：（根據(jù)熒光值的強(qiáng)弱變化，量化分析不同組別細(xì)胞的增殖水平，明確目的基因或藥物的作用效果）
（3）MTT實(shí)驗(yàn)
MTT實(shí)驗(yàn)是經(jīng)典的細(xì)胞增殖檢測(cè)方法，通過檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)線粒體脫氫酶的活性，間接反映細(xì)胞增殖數(shù)量及活性，可用于評(píng)估目的基因或藥物對(duì)細(xì)胞增殖的影響，操作簡(jiǎn)便、成本較低。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果：（通過酶標(biāo)儀檢測(cè)各組吸光度值，分析細(xì)胞增殖活性差異，明確實(shí)驗(yàn)干預(yù)因素的作用效果）
細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)
細(xì)胞凋亡是腫瘤研究、發(fā)育生物學(xué)研究的核心重點(diǎn)，同時(shí)也是藥理學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。其定義為：細(xì)胞在生理或病理?xiàng)l件下，遵循自身內(nèi)在程序，主動(dòng)、有序地結(jié)束生命的過程，該過程受基因嚴(yán)格調(diào)控，且有一系列酶（如Caspase）參與其中。細(xì)胞凋亡的完整過程大致可分為四個(gè)階段：接受凋亡信號(hào)→凋亡調(diào)控分子相互作用→蛋白水解酶（Caspase）活化→啟動(dòng)連續(xù)的凋亡反應(yīng)。
實(shí)驗(yàn)常用方法為：通過慢病毒感染構(gòu)建特定基因過表達(dá)的細(xì)胞株，采用Annexin-PE和7-AAD雙染法，分別檢測(cè)正常細(xì)胞、對(duì)照組細(xì)胞及基因過表達(dá)組細(xì)胞的凋亡情況，進(jìn)而探究該基因?qū)?xì)胞凋亡的調(diào)控作用。
實(shí)驗(yàn)步驟：細(xì)胞準(zhǔn)備→收集各組細(xì)胞→加入Annexin-PE和7-AAD試劑進(jìn)行雙染色→流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果：（通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)數(shù)據(jù)，分析各組細(xì)胞的凋亡率，明確目的基因?qū)?xì)胞凋亡的促進(jìn)或抑制作用）
? ?
細(xì)胞侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)
在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，腫瘤細(xì)胞穿透組織屏障、進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)的能力，是影響腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵，也是相關(guān)研究的核心內(nèi)容。調(diào)控細(xì)胞侵襲和遷移的信號(hào)通路，主要集中在細(xì)胞黏附調(diào)控和細(xì)胞骨架調(diào)控兩大方向，因此細(xì)胞侵襲與遷移能力的變化，主要與細(xì)胞骨架重構(gòu)及細(xì)胞黏附能力改變相關(guān)。目前，Transwell實(shí)驗(yàn)是檢測(cè)腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移能力的常用方法，細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)也可用于測(cè)定腫瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)特性，但由于其無法區(qū)分細(xì)胞增殖與細(xì)胞遷移的貢獻(xiàn)，應(yīng)用范圍存在一定局限性。
（1）Transwell實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)
Transwell小室的底層設(shè)有一張通透性聚碳酸酯膜，將其放置于培養(yǎng)孔板中后，小室內(nèi)側(cè)稱為上室，培養(yǎng)孔板內(nèi)側(cè)稱為下室。借助聚碳酸酯膜的通透性，下室培養(yǎng)液中的營養(yǎng)成分、趨化因子等可擴(kuò)散至上室，進(jìn)而影響上室內(nèi)細(xì)胞的生長、運(yùn)動(dòng)等行為。該實(shí)驗(yàn)可廣泛用于研究下室成分對(duì)細(xì)胞生理行為的調(diào)控作用。
（2）腫瘤遷移實(shí)驗(yàn)
該實(shí)驗(yàn)主要用于研究腫瘤細(xì)胞本身的遷移能力，或特定實(shí)驗(yàn)條件下腫瘤細(xì)胞遷移能力的變化。實(shí)驗(yàn)常用8.0、12.0μm孔徑的聚碳酸酯膜，上室接種腫瘤細(xì)胞，下室加入胎牛血清（FBS）或特定趨化因子，腫瘤細(xì)胞會(huì)向營養(yǎng)成分濃度較高的下室遷移，通過計(jì)數(shù)進(jìn)入下室的細(xì)胞數(shù)量，即可量化評(píng)估腫瘤細(xì)胞的遷移能力。
（3） 腫瘤侵襲實(shí)驗(yàn)
該實(shí)驗(yàn)用于研究腫瘤細(xì)胞的侵襲能力，或特定條件下腫瘤細(xì)胞侵襲能力的改變。實(shí)驗(yàn)中，需在聚碳酸酯膜表面涂抹一層基質(zhì)膠，模擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)環(huán)境，上室接種腫瘤細(xì)胞，下室加入FBS或特定趨化因子。腫瘤細(xì)胞需先降解基質(zhì)膠，才能穿過聚碳酸酯膜遷移至下室，通過計(jì)數(shù)進(jìn)入下室的細(xì)胞數(shù)量，可明確腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。
本實(shí)驗(yàn)的核心目的：探究目的基因過表達(dá)或干擾后，對(duì)細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移能力的調(diào)控作用。
實(shí)驗(yàn)步驟：細(xì)胞復(fù)蘇→Transwell小室鋪板→細(xì)胞培養(yǎng)及染色→顯微鏡拍照記錄。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果：（通過計(jì)數(shù)遷移/侵襲至下室的細(xì)胞數(shù)量，分析不同組別細(xì)胞侵襲、遷移能力的差異，明確目的基因的調(diào)控作用）
（4）細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)
腫瘤細(xì)胞在體外培養(yǎng)條件下仍保留遷移能力，細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)借鑒體外細(xì)胞致傷愈合模型，是測(cè)定腫瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)特性的經(jīng)典方法之一。其原理為：在體外培養(yǎng)的單層細(xì)胞上制造劃痕致傷，通過觀察并比較不同實(shí)驗(yàn)組中劃痕愈合速度，評(píng)估腫瘤細(xì)胞的遷移能力。
實(shí)驗(yàn)常用材料為篩選后的穩(wěn)定細(xì)胞株（轉(zhuǎn)染對(duì)照病毒、目的基因過表達(dá)病毒），通過對(duì)空細(xì)胞組、對(duì)照穩(wěn)轉(zhuǎn)組、目的基因穩(wěn)轉(zhuǎn)組的劃痕寬度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，探究目的基因?qū)?xì)胞遷移能力的影響。
實(shí)驗(yàn)步驟：細(xì)胞鋪板→劃痕制造→細(xì)胞培養(yǎng)及定時(shí)拍照→劃痕寬度統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果：（通過分析不同時(shí)間點(diǎn)的劃痕愈合率，量化各組細(xì)胞的遷移能力，明確目的基因的調(diào)控作用）
細(xì)胞周期檢測(cè)
細(xì)胞周期（cell cycle）是指細(xì)胞從一次分裂完成開始，到下一次分裂結(jié)束所經(jīng)歷的全過程，主要分為間期和分裂期兩個(gè)階段，其長短直接反映細(xì)胞的增殖速度。單個(gè)細(xì)胞的周期可通過縮時(shí)攝影法測(cè)定，但該方法無法反映細(xì)胞群體的整體周期特征，因此目前科研中多采用其他方法檢測(cè)細(xì)胞群體的周期分布。
實(shí)驗(yàn)常用方法：通過慢病毒感染構(gòu)建目的基因過表達(dá)細(xì)胞株，采用PI染色法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)，檢測(cè)各組細(xì)胞的周期分布情況，進(jìn)而探究目的基因?qū)?xì)胞周期的調(diào)控作用。
實(shí)驗(yàn)步驟：細(xì)胞準(zhǔn)備→樣品收集與處理→流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)→數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果：（分析各組細(xì)胞在G1期、S期、G2/M期的比例，明確目的基因?qū)?xì)胞周期進(jìn)程的影響，判斷其是否調(diào)控細(xì)胞增殖速度）
克隆形成實(shí)驗(yàn)
該實(shí)驗(yàn)的核心目的是，通過對(duì)目的基因過表達(dá)/干擾細(xì)胞組、空細(xì)胞組及陰性對(duì)照組（空病毒轉(zhuǎn)染組）的克隆形成數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，探究目的基因?qū)?xì)胞群體依賴性及增殖能力的影響，可直觀反映細(xì)胞的長期增殖潛能。
實(shí)驗(yàn)步驟：細(xì)胞鋪板→恒溫培養(yǎng)→克隆觀察、染色→計(jì)數(shù)并計(jì)算克隆形成率。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果：（通過比較各組克隆形成率的差異，明確目的基因?qū)?xì)胞長期增殖能力的調(diào)控作用）
