大家好，本周給大家分享的是最近發(fā)表在PNAS上與番茄含氮香氣揮發(fā)物相關(guān)的一篇文章。
文章題目：A flavin-dependent monooxygenase produces nitrogenous tomato aroma volatiles using cysteine as a nitrogen source (一種黃素依賴的單加氧酶利用半胱氨酸作為氮源產(chǎn)生含氮的番茄香氣揮發(fā)物)
期刊： Proceedings of the National Academy of Sciences (PNAS)
影響因子： 2020_IF = 11.205; 中科大類: 綜合性期刊 1區(qū); 中科小類: 綜合性期刊 1區(qū); JCR分區(qū): Q1
發(fā)文單位：加拿大Vineland研究與創(chuàng)新中心、布魯克大學(xué)等9家單位。
文章作者：加拿大Vineland研究與創(chuàng)新中心David K. Liscombe 為第一作者，加拿大拉瓦爾大學(xué)Charles Goulet 為通訊作者。
摘要：番茄在果實(shí)成熟過程中會產(chǎn)生多種揮發(fā)性化學(xué)物質(zhì)，產(chǎn)生獨(dú)特的香氣，有助于形成整體風(fēng)味。這些揮發(fā)物中有幾種芳香族和脂肪族含氮化合物，其生物合成途徑尚不清楚。雖然在番茄果實(shí)中這些含氮揮發(fā)物含量豐富，但它們在不同番茄枝的近緣種果實(shí)中的含量變化很大。比如綠果番茄潘那利番茄（S. pennellii）幾乎檢測不到，而紅果栽培番茄（S. lycopersicum）和醋栗番茄（Solanum pimpinellifolium）含量相對較高。利用一個來自潘那利番茄的漸滲群體，作者確定了番茄果實(shí)中所有可檢測到的含氮揮發(fā)物的產(chǎn)生所必需的位點(diǎn)。番茄轉(zhuǎn)基因植株中潛在基因（SlTNH1；Solyc12g013690）的沉默消除了成熟果實(shí)中脂肪族和芳香族含氮揮發(fā)物的產(chǎn)生，對這些果實(shí)的代謝組學(xué)分析揭示了一種已知的半胱氨酸和3-甲基丁醛的結(jié)合物2-異丁基-四氫噻唑烷-4-羧酸的積累。在2-異丁基噻唑和2-苯乙腈中合成穩(wěn)定同位素標(biāo)記的前體，證實(shí)半胱氨酸為番茄果實(shí)中所有含氮揮發(fā)物提供氮原子。表達(dá)SlTNH1的煙草植株很容易將合成的2-取代四氫噻唑烷-4-羧酸底物轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的2-取代肟、硝基和腈揮發(fā)物的混合物。與植物中其他已知的依賴黃素的單加氧酶不同，這種四氫三噻唑烷-4-羧酸N-羥化酶催化順序羥基化。闡明這一途徑是理解并最終改善番茄風(fēng)味品質(zhì)的重要一步。
主要結(jié)果：
1、產(chǎn)生含氮揮發(fā)性物質(zhì)的必需基因
番茄果實(shí)會產(chǎn)生一些相對少見含氮揮發(fā)物，包括2-苯乙腈（芐基氰化物）、1-硝基-2-苯乙烷、3-甲基丁腈（異戊腈）、1-硝基-3-甲基丁烷和2-異丁基噻唑（圖1A）。在一個潘那利IL群體（28）中篩選了影響成熟果實(shí)含氮揮發(fā)物合成的QTL。在這些品系中，相對于番茄親本背景（M82），IL12-2、IL12-3-1和IL12-3表現(xiàn)出含氮揮發(fā)物的顯著減少（圖1B）。測量每個株系的揮發(fā)性圖譜，以精細(xì)定位含氮揮發(fā)性QTL（圖1C），最后將QTL定位到預(yù)測包含16個基因的100kb的區(qū)域。其中，Solyc12g013690注釋為“單加氧酶FAD結(jié)合蛋白”，被認(rèn)為是最佳候選基因。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)Solyc12g013690轉(zhuǎn)錄水平在四個獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因株系中顯著降低（圖2A）。與對照相比，四個株系的含氮揮發(fā)物都顯著減少（圖2B）。在轉(zhuǎn)基因株系中，相關(guān)苯丙氨酸和亮氨酸衍生的醇和醛的含量沒有受到影響，表明該基因主要影響含氮揮發(fā)物。
圖1. Chr12上的一個基因（Solyc12g013690）負(fù)責(zé)番茄果實(shí)中氮揮發(fā)物的生物合成。（A）番茄果實(shí)中主要氮揮發(fā)物的結(jié)構(gòu)。（B）ILs和番茄親本(M82)成熟果實(shí)的氮揮發(fā)物含量。（C）12號染色體上氮揮發(fā)相關(guān)QTL的精細(xì)定位。一組含氮揮發(fā)物含量低或高（野生型）的重組子來自M82和IL12-2之間的雜交。
圖2. 反義介導(dǎo)的Solyc12g013690（SlTNH1）沉默導(dǎo)致水果中含氮風(fēng)味揮發(fā)物的顯著減少。(A) 與對照相比，四個獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因株系果實(shí)中的轉(zhuǎn)錄水平。（B）對照株系和轉(zhuǎn)基因株系切開成熟果實(shí)檢測到的含氮揮發(fā)物含量。
作者測量了番茄果實(shí)在不同階段中2-苯乙腈、1-硝基-2-苯乙烷、3-甲基丁腈、1-硝基-3-甲基丁烷和2-異丁基噻唑的含量，以確定它們的積累是否也像許多其他風(fēng)味揮發(fā)物一樣與成熟過程有關(guān)。M82中的五種主要含氮揮發(fā)物在成熟前低于檢測水平，但在成熟過程中顯著增加（圖3A）。定量PCR分析表明，Solyc12g013690在果實(shí)成熟初期表達(dá)升高，在完全成熟階段達(dá)到最高水平（圖3B），這與含氮揮發(fā)性物質(zhì)的產(chǎn)生模式一致。綠熟期乙烯處理導(dǎo)致野生型（WT）果實(shí)中的Solyc12g013690表達(dá)增加。在乙烯不敏感突變體“Never-ripe”中，這種增加顯著減弱（圖3C）。用1-甲基環(huán)丙烯（1-MCP）處理成熟果實(shí)，可降低Solyc12g013690的表達(dá)（圖3C），表明番茄果實(shí)中含氮揮發(fā)性物質(zhì)的產(chǎn)生依賴于乙烯。
圖3. 番茄中與成熟相關(guān)的含氮揮發(fā)物積累和Solyc12g013690（SlTNH1）表達(dá)。(A) M82果實(shí)成熟過程中含氮揮發(fā)物的含量。（B）番茄M82葉片、花朵和整個果實(shí)成熟（未成熟、破色、轉(zhuǎn)色和成熟期）中的Solyc12g013690轉(zhuǎn)錄水平。（C）對乙烯（ET）響應(yīng)的Solyc12g013690轉(zhuǎn)錄水平。
2、基因沉默導(dǎo)致含硫底物的積累
非靶向超高效液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜（UPLC-QTOF-MS）分析成熟果實(shí)，并比較Solyc12g013690沉默株系（圖4C）與未沉默對照組的代謝物圖譜，結(jié)果顯示質(zhì)譜特征，“5.40_190.0896m/z”，在反義株系中持續(xù)累積（圖4B）。此外，與WT相比，分離的EMS誘導(dǎo)的終止密碼子變異株系（W278）含有顯著更高水平的這種代謝特征（圖4B）。在研究中發(fā)現(xiàn)一種化合物是S-異丁基四氫噻唑烷-4-羧酸（IT4C）的環(huán)狀類似物（圖4A）。作者以L-半胱氨酸和3-甲基丁醛為原料合成了IT4C，并通過質(zhì)子核磁共振對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了驗(yàn)證。通過UPLC-QTOF-MS分析，番茄果實(shí)的該質(zhì)譜5.40_190.0896m/z特征的保留時間、準(zhǔn)確質(zhì)量和裂解方式與合成IT4C相匹配，確認(rèn)這個代謝物的身份（圖4C）。另外發(fā)現(xiàn)， IT4C可能是Solyc12g013690的底物，這意味著半胱氨酸是含氮揮發(fā)物的氮源。
圖4. SlTNH1活性受損導(dǎo)致番茄果實(shí)中2-異丁基四氫噻唑烷-4-羧酸（IT4C）的積累。(A) IT4C可以由L-半胱氨酸和3-甲基丁醛輕松合成。（B）UPLC-QTOF-MS的非靶向代謝組學(xué)顯示，IT4C在SlTNH1反義株系和終止密碼子變異中積累。(C) m/z 190.0902的萃取離子色譜圖顯示，SlTNH1反義株系中積累的代謝特征被明確確定為IT4C。
3、半胱氨酸為含氮揮發(fā)物提供氮原子和四氫噻唑烷N-羥化酶
為了研究氮原子在含氮揮發(fā)物生物合成中的來源，通過將穩(wěn)定同位素標(biāo)記的生物合成前體摻入 2-異丁基噻唑和 2-苯基乙腈中，該研究證實(shí)了半胱氨酸是番茄果實(shí)中所有含氮揮發(fā)物的氮來源。煙草葉片瞬時表達(dá)Solyc12g013690，2-苯乙醛衍生的四氫噻唑烷底物很容易轉(zhuǎn)化為2-苯乙腈和1-硝基-2-苯乙烷（圖5B），確定半胱氨酸是這些無硫代謝物中的活性氮源。重組SlTNH1與2-取代四氫噻唑烷底物（圖5A和B）結(jié)合產(chǎn)生的揮發(fā)性圖譜再現(xiàn)了番茄果實(shí)產(chǎn)生氮揮發(fā)性的生物合成能力，根據(jù)其催化順式N-羥基化將該酶命名為四氫噻唑烷-羥基化酶(TNH)。
圖5. Solyc12g013690編碼一種四氫噻唑烷N-羥化酶（TNH），并將2-四氫噻唑烷轉(zhuǎn)化為含氮風(fēng)味揮發(fā)物。(A)番茄果實(shí)中依賴TNH的氮揮發(fā)性生物合成模型。（B-C）含氮風(fēng)味揮發(fā)物是通過瞬時表達(dá)SlTNH1，并補(bǔ)充由2-苯乙醛和L-半胱氨酸（B）以及3-甲基丁醛和L-半胱氨酸（C）制成的相應(yīng)噻唑烷在煙草葉片中產(chǎn)生。
總之該研究證明，一種黃素-單加氧酶型酶TNH負(fù)責(zé)番茄中多種芳香族和脂肪族含氮揮發(fā)性化合物的生物合成，并利用自發(fā)形成的半胱氨酸結(jié)合物作為底物。這一發(fā)現(xiàn)定義了一條依賴半胱氨酸途徑進(jìn)入植物中的含氮揮發(fā)物，促使人們重新考慮硫代謝對番茄風(fēng)味和品質(zhì)的影響。
文中所有圖片均來自A flavin-dependent monooxygenase produces nitrogenous tomato aroma volatiles using cysteine as a nitrogen source
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參考文獻(xiàn)：
Liscombe D K, Kamiyoshihara Y, Ghironzi J, et al. A flavin-dependent monooxygenase produces nitrogenous tomato aroma volatiles using cysteine as a nitrogen source[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2022, 119(7).
