大家好，本周給大家分享的是一篇發(fā)表在nature plants上的關(guān)于 crispr-cas9技術(shù)誘導(dǎo)擬南芥同源染色體易位 的文章。
文章題目：CRISPR–Cas9-mediated induction of heritable chromosomal translocations in?Arabidopsis(CRISPR-Cas9 介導(dǎo)的擬南芥遺傳染色體易位誘導(dǎo))
期刊：Nature Plants
影響因子：IF = 15.793;
發(fā)文單位： 德國卡爾斯魯厄技術(shù)研究所,德國萊布尼茨植物遺傳學(xué)和作物植物研究所(IPK)等單位。
文章作者：德國卡爾斯魯厄技術(shù)研究所的Natalja Beying為第一作者， 德國萊布尼茨植物遺傳學(xué)和作物植物研究所的Andreas Houben 和德國卡爾斯魯厄技術(shù)研究所的Holger Puchta為通訊作者。
摘要：CRISPR–Cas9技術(shù)主要應(yīng)用于植物育種中，用于改善單或多性狀的基因。此文獻(xiàn)展示了這種技術(shù)也可以用于重組植物染色體。利用金黃色葡萄球菌的Cas9核酸酶，本文實(shí)驗(yàn)團(tuán)隊(duì)誘導(dǎo)了擬南芥異源染色體間Mbp范圍內(nèi)的相互易位，并觀察到在沒有經(jīng)典的非同源端連接途徑的情況下，易位頻率大約提高了5倍。通過分子和細(xì)胞學(xué)分析，作者證實(shí)了擬南芥1號、2號染色體之間，1號、5號染色體之間的染色體臂交換是保守的和互作的。染色體易位的誘導(dǎo)可以模擬基因組的進(jìn)化或有方向的修改染色體、固定或打破不同染色體性狀之間的遺傳聯(lián)系。植物基因組的可控重組具有改變植物育種的潛力。
實(shí)驗(yàn)思路：
?????? DSB的修復(fù)途徑主要為以下兩種，在植物中NHEJ是體細(xì)胞中普遍存在的修復(fù)途徑。一次誘導(dǎo)多個DSB可以通過NHEJ連接不相關(guān)的斷裂末端，導(dǎo)致基因組重排。因此在異源染色體上同時誘導(dǎo)兩種DSB可能會導(dǎo)致相互易位的形成。
實(shí)驗(yàn)方案：
?????? 為了形成易位，實(shí)驗(yàn)使用來自金黃色葡萄球菌的Cas9核酸酶(SaCas9)誘導(dǎo)擬南芥1號染色體(Chr1)和Chr2上的兩個dsb (TL1-2)。Cas9核酸酶的靶位點(diǎn)被設(shè)計(jì)為切于Chr1和Chr2長染色體臂末端0.5 Mbp的基因間區(qū)域(圖1a)。為了確定CRISPR在體細(xì)胞中造成的易位頻率事件，我們通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的浸花方法對col0植株中的CRISPR構(gòu)建物進(jìn)行了轉(zhuǎn)化，并選擇生長兩周后的植株為初代轉(zhuǎn)化子。設(shè)置了6個生物重復(fù)，每個重復(fù)收集100株植物用于提取基因組DNA。使用帶位點(diǎn)特異性引物的數(shù)字滴式PCR(ddPCR)對易位頻率進(jìn)行定量測量，連接位點(diǎn)附近序列的變化作為鑒定到易位的標(biāo)志。實(shí)驗(yàn)檢測到TL1-2在兩個連接處的易位頻率約為0.01%，表明使用CRISPR-Cas9確實(shí)可以實(shí)現(xiàn)染色體臂的相互交換。為了確定哪些修復(fù)途徑參與了植物體細(xì)胞易位的形成，實(shí)驗(yàn)通過下一代測序(NGS)檢查了連接位點(diǎn)的序列模式。序列顯示在野生型背景下，約60%的事件顯示無錯連接，其余事件為小規(guī)模序列缺失。大多數(shù)情況下沒有核苷酸丟失，最可能的原因是新連接為嵌合連接，與最初切割位點(diǎn)相反，不能再被Cas酶識別。這說明主要是cNHEJ通路導(dǎo)致了染色體易位的形成。同時還分析了在敲除cNHEJ關(guān)鍵酶KU70后易位的形成。結(jié)果顯示，敲除KU70使易位頻率增加了約5倍，接近0.05%。這說明在沒有cNHEJ的情況下，aNHEJ能夠有效地形成易位
?????? 實(shí)驗(yàn)通過遺傳轉(zhuǎn)化得到T0代初級轉(zhuǎn)化子，T0代授粉自交得到T1代，T1代進(jìn)行基因分型挑選出40個含易位事件的植株進(jìn)行T2代植株種植培養(yǎng)。40個T2植株混樣提取DNA進(jìn)行基因分型篩選，另外同時進(jìn)行單株的篩選。挑選具有易位事件的單株進(jìn)行T3代種植培養(yǎng)。單株檢測易位事件隨后繼續(xù)分離培養(yǎng)。c-e：半合子狀態(tài)下的相互易位分離示意圖。T2植株的染色體組分別有野生型(1和2)和嵌合型(J1和J2)拷貝(c);因此，它們的配子要么攜帶野生型單倍體染色體組，要么攜帶易位染色體組，要么攜帶缺乏部分遺傳信息的兩組染色體(用紅色十字標(biāo)記;d);在T3代中，如果所有4個配子都沒有偏置轉(zhuǎn)移到下一代，理論上可以產(chǎn)生16種基因型組合(e)。然而，一半(8)的受精事件會導(dǎo)致染色體不平衡(黃色)，兩個細(xì)胞將失去遺傳信息(紅色)，只有六個組合(綠色)可以解釋一個平衡的二倍體后代。在這六種平衡的基因型中，有四種是雜合子的易位，這意味著它們同時攜帶原染色體和重組后的染色體。兩種基因型來自不平衡的配子組合(淺綠色)，兩種來自平衡的配子組合(深綠色)。因此，如果不平衡的配子不能貢獻(xiàn)后代，16個合子中只能產(chǎn)生4個存活的合子(1個純合子野生型，2個雜合子易位和1個純合子易位)，導(dǎo)致易位染色體的準(zhǔn)孟德爾分離(1:2:1)。T2分析中，所有轉(zhuǎn)化株系均檢測到兩個連接位均為陽性的植株，Col-0和ku70-1的易位頻率分別為0.125%和0.5%。在得到的T3代中，每個T3株系篩選到40株，由于沒有檢測到不平衡的染色體組，觀察到向平衡后代的轉(zhuǎn)移。用χ2檢驗(yàn)檢驗(yàn)易位連接的擬孟德爾分離。
?????? 通過使用不同DNA探針，針對Chr1(紅色)和Chr2(綠色)易位斷點(diǎn)區(qū)域進(jìn)行FISH，觀察到了野生型和易位植株有絲分裂和自然延伸的粗線期染色體。遺傳易位事件的兩個連接位點(diǎn)J1(b)和J2(c)的測序結(jié)果顯示在野生型背景的4個T4細(xì)胞株中，有3個細(xì)胞株在兩個連結(jié)處均無錯誤連接，另一個細(xì)胞株在一個連結(jié)處有小的缺失。兩者都分析了ku70-1背景下的易位事件在兩個連接處的突變特征是aNHeJ修復(fù)。
?????? 相同的實(shí)驗(yàn)流程在Chr1和Chr5之間進(jìn)行了易位誘導(dǎo)，野生背景下攜帶易位事件的40個T2株系中有一個單株為易位陽性，T3分析未檢測到配子不平衡導(dǎo)致的基因型，10%的子代為純合子易位。測序分析顯示兩個連接位點(diǎn)都有小的缺失。使用不同標(biāo)記的探針對易位區(qū)域進(jìn)行FISH，三次重復(fù)結(jié)果一致表現(xiàn)易位現(xiàn)象。
a，四個不同編輯位點(diǎn)上SaCas9的編輯效率??? b，Col-0在連接位點(diǎn)上的缺失多為中小缺失，而ku70突變體在兩個連接位點(diǎn)上的缺失量較大。c，在野生型中，大多數(shù)連接是直接連接的，在連接位點(diǎn)沒有任何突變誘導(dǎo)。在顯示連接位點(diǎn)突變的reads中，大多數(shù)連接不使用MHs，只有少數(shù)連接使用MHs。相比之下，在ku70突變背景中幾乎沒有無錯誤的連接發(fā)生，在連接位點(diǎn)普遍的修復(fù)模式顯示使用MHs連接。d, e，野生型和突變型中兩個連接位點(diǎn)在序列水平上最常見的10個reads的詳細(xì)表示。
???? 為了證明沒有序列信息丟失，在易位染色體上每100kb擴(kuò)增出一個約2.5kb的典型擴(kuò)增。圖a。易位染色體部分PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳圖顯示易位染色體每100KB就能檢測到一條條帶，表明易位形成過程中沒有信息丟失。作為PCR對照，將未易位形成的野生型基因組DNA(陽性對照)和水(nTC=無模板對照，陰性對照)同時處理，并加載在不同的凝膠上。表型分析和育性分析(測量5個生物學(xué)獨(dú)立樣本的角果長度和種子數(shù))顯示易位植株和野生植株并無差別。d,e，育性分析是通過測量5個生物學(xué)獨(dú)立樣本(n=5)的角果長度和計(jì)數(shù)種子數(shù)進(jìn)行的。Barplots顯示平均值，errorbars為mean±s.d。對于兩個攜帶TL1-2的分析品系，我們無法檢測到任何差異。
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