四、分子點(diǎn)睛（變量一、分子）
恒量為PART1中的疾、型、模、法、標(biāo)
在這中間套變量，分子，有兩個問題重點(diǎn)討論
1、怎么證明一個分子有某個方面功能表型？
唯一的干預(yù)因素（加，Gain of function，或者over-expression/反之，Loss of function）
所以證明一個分子有某個方面的功能表型 的方法，就是操作分子，人為的改變這個分子的表達(dá)，讓這個分子表達(dá)上升，觀察到表型， 然后再把這個分子表達(dá)降低，觀察到表型消失了，這就證明了表型的存在與分子的上下表達(dá) 有明顯的相關(guān)性，由此可以下結(jié)論。
+設(shè)立對照組
過表達(dá)方法：質(zhì)粒或者病毒
質(zhì)粒：環(huán)狀DNA分子，作為專門表達(dá)基因的分子設(shè)備，自帶一套完整元件，因?yàn)榧?xì)胞膜是磷脂雙分子層，質(zhì)粒DNA自己無法穿進(jìn)去，所以需要特定試劑等方法，稱為轉(zhuǎn)染transfection（常用的有脂質(zhì)體，與細(xì)胞膜有親和性，與細(xì)胞膜可融合；還有電穿孔法與磷酸鈣轉(zhuǎn)染，簡稱鈣轉(zhuǎn)），什么細(xì)胞用什么轉(zhuǎn)染方式效果，需要摸索實(shí)驗(yàn)。
轉(zhuǎn)染質(zhì)粒這個經(jīng)典操作，就用 Transfection，而質(zhì)粒在大腸桿菌里做轉(zhuǎn)化，叫 Transformation
如果很難轉(zhuǎn)，就改用病毒（如神經(jīng)細(xì)胞，干細(xì)胞，原代細(xì)胞等）
有些病毒還有細(xì)胞的親噬性，可以靶向一些細(xì)胞，特異性的感染。感染叫 infection， 也可以用轉(zhuǎn)導(dǎo)，transduction
反正目的都是為了某個基因的過表達(dá)，觀察表型的變化從而確認(rèn)它有無預(yù)期功能。
抑制：RNA干擾技術(shù)（抑制更常用）
因?yàn)獒t(yī)學(xué)研究里，我們關(guān)注的分子往往是疾病的致病因素，是伴隨疾病 的發(fā)生表達(dá)增高的，我用 Loss of function 人為的抑制它的表達(dá)，這樣可以觀察是否疾病相關(guān) 的表型會減輕，起到治療的模擬作用。
常規(guī)來說，疾病中高表達(dá)的基因，我們可以采用下調(diào) 手段來研究，而疾病中低表達(dá)的基因，也就是一些預(yù)防性的分子，我們可以采用上調(diào)手段研 究，這樣更合乎邏輯。生物系統(tǒng)非常復(fù)雜，但一個分子在疾病中只有高了或者低了一種穩(wěn)定 狀態(tài)，很少會遇到動態(tài)變化的案例。即使是高或者低一種狀態(tài)，也可以一正一反來回驗(yàn)證。 前面講模型的時(shí)候提到細(xì)胞株，一個疾病可能有多株細(xì)胞株，那么圍繞一個分子你也能找到 相對高表達(dá)的和相對低表達(dá)的細(xì)胞，在高表達(dá)的里面抑制分子，在低表達(dá)的里面過表達(dá)分子 就能實(shí)現(xiàn)正反雙向研究，這種套路很嚴(yán)謹(jǐn)也很常見。
RNAi 技術(shù)的革命性意義就在于它太便利了，只要合成一段 21 個 堿基的 siRNA，轉(zhuǎn)染到細(xì)胞里就能對目標(biāo)基因?qū)崿F(xiàn) 70%以上的表達(dá)沉默。RNAi 的運(yùn)作機(jī)制是細(xì)胞自帶的 ，當(dāng) si RNA 進(jìn)入細(xì) 胞的時(shí)候 ，會被一個叫RISC( RNA induced sliencing complex) 復(fù)合體的蛋白結(jié)合，然后以序列互補(bǔ)的形式找 siRNA匹配的mRNA靶點(diǎn)，一旦配上就啟動核酸內(nèi)切酶活性把特定基因的mRNA降解掉，從而高效、特異地阻斷體內(nèi)特定基因表達(dá)。 siRNA的設(shè)計(jì)有一些原則，但并不是特別難，一個基因可供選擇的 siRNA序列很多，比如sigma 網(wǎng)站上就有人基因預(yù)設(shè)計(jì)的 siRNA 序列，一般來說設(shè)計(jì)三條 siRNA 總有一條是有效的。這也是為什么做 RNAi 實(shí)驗(yàn)時(shí)候一般多做幾條序列的原因，要先篩一篩有效序列然后進(jìn)行功能驗(yàn)證。用 RNAi 沉默基因有個術(shù)語叫 Knockdown，翻譯過來叫敲降或者叫敲減，這是跟基因敲除的 Knockout 是相對應(yīng)的。
還有一些其他的基因編輯方法可以實(shí)現(xiàn)基因的 Knockout，在 DNA 水平把基因的編碼序列 DNA 破壞掉。比如鋅指酶 ZFN 和另一種核酸酶 TALEN，現(xiàn)在被CRISPR基本取代，因?yàn)镃RISPR 改良之后幾乎跟 RNAi 一樣方便。你就設(shè)計(jì)一段 sgRNA，跟 siRNA 差不多，然后導(dǎo)入一個 Cas9 核酸酶蛋白，差不多就搞定了。它比 RNAi 就多了一個Cas9 蛋白共轉(zhuǎn)，過表達(dá) Cas9 的模型細(xì)胞其實(shí)可以做好了備在那里用，所以真的很方便。
2、分子有很多具體的類型
基因DNA，在腫瘤中不穩(wěn)定，突變?nèi)笔?br>
除了DNA本身序列變化外，表觀遺傳學(xué)的改變，可以造成基因表達(dá)水平的變化，mRNA和蛋白質(zhì)發(fā)生變化
現(xiàn)階段的爆款，RNA，而且是非編碼RNA
在 2001 年，Science 雜志的一篇文章中第一次出 現(xiàn) microRNA 的概念，micro 就是微小的意思，因?yàn)檫@種 RNA 分子很短，長度只有 20 個堿 基左右，所以叫 microRNA。概念的確認(rèn)是 2001 年，但最早的一條 miRNA 要追溯到 1993 年，在模式生物線蟲中被發(fā)現(xiàn)的。當(dāng)時(shí)哈佛大學(xué)的研究者在一項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)，有一個控制線蟲發(fā)育的基因 lin-4 并不編碼蛋白質(zhì)，而是合成兩個小的 RNA 分子。其中一個長度約 22nt， 另一個約 61nt。較長的小 RNA 具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)，被認(rèn)為是較短那個的前體。進(jìn)一步研究證實(shí) lin-4 RNA 與 lin-14 基因 mRNA 的 3’非翻譯區(qū)形成多個位點(diǎn)的互補(bǔ)結(jié)合，從而對基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，能夠顯著減少 Lin-14 蛋白的合成，但并不減少它 mRNA 的表達(dá)量。那個時(shí)候，科學(xué)家們還認(rèn)為這是個案。在 lin-4 發(fā)現(xiàn)后的 7 年中，在各種生物中都沒有發(fā)現(xiàn)與 lin-4 相似 的 RNA。直到 let-7 這個 miRNA 的出現(xiàn)改變了這種認(rèn)識，同樣是 22 堿基長度，同樣控制線 蟲發(fā)育時(shí)相，let-7 與lin-4 采取相同的作用方式，控制線蟲由晚期幼蟲向成蟲的轉(zhuǎn)化。Lin-4 是線蟲由幼蟲第一階段向第二階段轉(zhuǎn)化的調(diào)控環(huán)節(jié)，由于這兩個 miRNA 在控制線蟲發(fā)育時(shí)相方面有相似的功能，科學(xué)家們就覺得不是偶然了。
在 2001 年，Science 就同一期報(bào)道了 3 個研究小組，在線蟲、果蠅和人 cDNA 文庫中鑒定出的近百個與 lin-4 和 let-7 相似的的小分子 RNA，并統(tǒng)一命名為 microRNA (miRNA，微 RNA)。miRNA 的發(fā)現(xiàn)可 以算是非編碼 RNA 研究的里程碑，它揭示了細(xì)胞中存在一個由內(nèi)源非編碼 RNA 介導(dǎo)的， 轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控的普遍機(jī)制。這之后科學(xué)家在大量生物體中發(fā)現(xiàn)了數(shù)以千計(jì)的 microRNA。 它們都是大約 22nt 長度的內(nèi)源性 RNA 分子，由莖環(huán)結(jié)構(gòu)的前體加工而成，而且在進(jìn)化過程 中一般比較保守。MicroRNA 的作用是可以負(fù)向調(diào)節(jié)一個基因的表達(dá)，幾個 miRNA 可以共同調(diào)節(jié)同一個基因。一個 miRNA 也可以同時(shí)調(diào)節(jié)幾個基因，形成一個復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。據(jù) 推測，miRNA 至少調(diào)節(jié)著人類三分之一的基因。
區(qū)別：siRNA 是一個研究工具，做基因沉默的時(shí)候用來抑制一個表達(dá)基因的，而 microRNA 是研究對象，是你研究的靶分子一 種類型，miRNA 并不能人為設(shè)計(jì)好用于做沉默實(shí)驗(yàn)，這就是他們之間不同。作為研究對象， miRNA 是內(nèi)源的，而 siRNA 大部分是外源導(dǎo)入的，雖然內(nèi)源性的也有，但大家基本碰不到， 屬于很小眾的研究方向
長鏈非編碼RNA，Long non-coding RNA, 簡稱 lncRNA。
lncRNA 是長度大于 200 個堿基的非編碼 RNA，不編碼蛋白，是一種調(diào)控性分子。lncRNA 的發(fā)現(xiàn)其實(shí)比 miRNA 還早，最早是1990年在哺乳動物的細(xì)胞中鑒定了第一個 lncRNA——H19。剛發(fā)現(xiàn)的時(shí)候也沒意識到它是普遍存在的調(diào)控分子。最近十年，是因?yàn)槭艿叫?RNA 研究的啟發(fā)以及新的測序技術(shù)推動，lncRNA 被大量鑒定出來，又發(fā)現(xiàn)它具有異常豐富的結(jié)構(gòu)和功能的多樣性，這就引起了研究者們極大的關(guān)注。miRNA作用方式比較簡單，lncRNA就復(fù)雜得多了，基本上蛋白能夠執(zhí)行的調(diào)控形式，lncRNA 都能參與。比如它可以像轉(zhuǎn)錄因子一樣，與編碼基因上游的啟動子區(qū)結(jié)合，干擾基因表達(dá)。它也可以通過與基因之間競爭轉(zhuǎn)錄因子的方式導(dǎo)致基因表達(dá)的沉默。它可以發(fā)揮像腳手架一樣的結(jié)構(gòu)作用將兩個蛋白連接在一起發(fā)揮功能。它也可以與蛋白編碼基因的轉(zhuǎn)錄本形成互補(bǔ)雙鏈，干擾 mRNA 的剪切，產(chǎn)生不同的剪切形式。還可以通過結(jié)合到特定蛋白上，改變該蛋白的活性或胞質(zhì)定位。LncRNA和 miRNA 也可以結(jié)合，作為 miRNA 的靶分子。它還可以作為小分子 RNA，如miRNA，piRNA的前體分子。lncRNA 涉及了基因表達(dá)調(diào)控的方方面面，所以研究的靈活性很大
miRNA 是非編碼必學(xué)的入門分子類型， 而 lncRNA 是進(jìn)階的不二選擇。
還有新的熱點(diǎn)，2012年有研究證實(shí)在人細(xì)胞的基因表達(dá)程序中，環(huán)狀RNA 分子(Circular RNAs，circRNA)是一種比線性RNA分子更普遍的特征。與傳統(tǒng)的線性RNA不同，circRNA 分子呈封閉環(huán)狀結(jié)構(gòu)，不受 RNA 外切酶影響，表達(dá)更穩(wěn)定不易降解。本質(zhì)上，circRNA 屬于 lncRNA 的一個分類，不是一種新的分子類型，正因?yàn)樗难芯刻卣鞲?lncRNA 一致，所以現(xiàn)有報(bào)道 circRNA 也比較全能，參與各種調(diào)控過程。在功能上，最主要 的一種作用形式是發(fā)現(xiàn)，circRNA 分子經(jīng)常富含 miRNA 的結(jié)合位點(diǎn)，在細(xì)胞中起到miRNA海綿(miRNA sponge)的作用，通過競爭性的結(jié)合 miRNA，就解除了 miRNA 原本對它靶基因的抑制作用，導(dǎo)致靶基因的表達(dá)水平上調(diào)。這種作用機(jī)制還有一個專業(yè)的名稱，叫競爭性內(nèi)源 RNA(ceRNA)。ceRNA 不是一種分子類型，而是描述了一種分子調(diào)控的機(jī)制模式。
