引言
現(xiàn)代藥物研發(fā)中，表型篩選到靶點驗證的過程頗具挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)篩選常用熒光、發(fā)光或放射性同位素標記，這類“外源性標簽”雖方便信號檢測，卻像?“雙刃劍”，易因空間位阻改變靶蛋白天然構象，或引入非特異背景信號，導致假陽性、假陰性結果。
隨著生物物理學與蛋白質組學的飛速發(fā)展，“免修飾”技術已成為藥物靶點篩選領域的新寵。這類技術最核心的優(yōu)勢在于：“所見即所得”——?即在不改變藥物分子和靶蛋白天然狀態(tài)的前提下，直接監(jiān)測分子間相互作用引起的物理化學性質變化（如質量、折射率、熱穩(wěn)定性、蛋白酶抗性等）。
結合權威數(shù)據(jù)庫及實驗方案庫的最新資料，今天我們將全方位拆解免修飾藥物靶點篩選技術，從純化蛋白的生物物理表征到細胞及裂解液環(huán)境的蛋白質組學靶點垂釣，為你提供詳盡的選型指南與實操避坑手冊。
01?基于光學與生物物理傳感器的純化蛋白篩選技術
當研究者已經獲得了純化的潛在靶點蛋白，或者需要對苗頭化合物進行親和力與動力學驗證時，基于生物傳感器的免修飾技術是首選。這類技術能夠實時監(jiān)測結合過程，提供動力學常數(shù)（kon，koff）和熱力學參數(shù)，這是僅靠終點法（如ELISA）無法獲取的維度。
1.?表面等離子體共振（SPR）：相互作用分析的“金標準”
??簡化原理：基于全內反射，偏振光照射金膜激發(fā)等離子體波，共振角與膜表面折射率相關，靶蛋白固定于芯片，化合物流過引發(fā)的共振角偏移（RU值）可量化相互作用。
?核心優(yōu)勢：
①?能解析結合/解離速率與平衡解離常數(shù)，體內療效與藥物駐留時間相關性更高；
②?新一代系統(tǒng)可檢測低至70Da的小分子片段，適配片段藥物篩選；
③?單次進樣即可形成濃度梯度，提升效率與數(shù)據(jù)質量。
?局限性：微流控系統(tǒng)復雜，流路易被粗樣品堵塞；緩沖液需嚴格匹配，儀器與芯片成本較高。
2.?生物層干涉技術（BLI）：高通量與抗干擾的平衡
如果說SPR是精密的“顯微鏡”，那么BLI就是高效的“流水線”。
?簡化原理：光纖尖端生物膜產生光干涉，分子結合導致膜厚增加，引發(fā)干涉光譜位移，采用“浸入即讀”模式，無需微流控管路。
?核心優(yōu)勢：
①?無堵塞風險，可直接檢測細胞裂解液、血清等粗樣品；
②?樣品檢測后可回收，支持96/384孔板高通量篩選，成本可控。
?局限性：靈敏度低于高端SPR，難以檢測＜150Da的超小分子或微弱結合信號。
3.?光柵耦合干涉技術（GCI）：靈敏度與動力學的雙重飛躍
GCI是近年來異軍突起的“黑馬”，旨在解決SPR在靈敏度和快動力學檢測上的瓶頸。
?簡化原理：光波導表面光柵耦合光產生倏逝波，延伸光與樣品相互作用長度，通過時間域相位變化監(jiān)測折射率改變，降低噪音。
?核心優(yōu)勢：
①?檢測極限＜50Da，可捕捉解離速率高達10s-1的瞬態(tài)結合；
②?耐受血清、細胞膜制備物，適用于膜蛋白研究。
?局限性：設備成本較高。
4.?純化蛋白篩選技術參數(shù)橫向對比
為了幫助大家更直觀地選擇，小譜將上述三種技術及后續(xù)將討論的技術進行了核心參數(shù)對比：
02?溶液內熱力學與微量熱泳動分析
盡管基于表面的生物傳感器功能強大，但“固定化”這一步驟本身可能會限制蛋白的構象自由度，或遮蔽結合位點。溶液內檢測技術則規(guī)避了這一風險。
1.?等溫滴定量熱法（ITC）：熱力學解析的“金標準”
?簡化原理：直接測量分子結合時的熱量變化，無需標記或固定，通過熱量信號量化相互作用。
?核心優(yōu)勢：一次實驗可獲取親和力、化學計量比、焓變、熵變，能區(qū)分焓驅動（氫鍵/范德華力，特異性好）與熵驅動（疏水作用，親脂性可能較高）結合，指導化合物優(yōu)化。
?局限性：樣品消耗大（毫克級）、通量低，不適合大規(guī)模初篩；對極高/極低親和力結合的擬合數(shù)據(jù)可能有偏差。
2.?微量熱泳動（MST）：微量、廣譜的溶液內檢測
?簡化原理：分子在溫度梯度中定向移動，配體結合改變分子水化層、大小等性質，導致熱泳動速度變化。
?核心優(yōu)勢：
①?樣品消耗僅4-10μL，檢測范圍覆蓋pM至mM級；
②?支持蛋白內源性色氨酸熒光檢測，適配無法標記或標記后失活的蛋白。
?技術陷阱：易受聚集與非特異性吸附干擾，可添加表面活性劑或使用特殊涂層毛細管；內源性熒光模式下，配體不可在UV區(qū)有強吸收。
03?復雜生物體系中的靶點垂釣與確證
當研究者通過表型篩選發(fā)現(xiàn)了一個具有生物活性的化合物（如誘導癌細胞凋亡的天然產物），但不知道其具體靶點時，上述基于純化蛋白的技術便無用武之地。此時，需要在細胞裂解液甚至活細胞層面進行的“靶點垂釣”技術成為了關鍵。
1.?細胞熱位移分析（CETSA）：活細胞內的靶點驗證
?簡化原理：藥物結合提升靶蛋白熱穩(wěn)定性，加熱后未結合藥物的蛋白變性沉淀，結合藥物的靶蛋白保持可溶。
?核心流程：藥物處理樣品→梯度/單一溫度熱激→離心分離→Western?Blot檢測可溶蛋白。
?實操要點：使用含非離子型去污劑的溫和裂解液，避免強離子型去污劑導致假陰性；先測定靶蛋白熔解溫度，篩選溫度設為80%-90%蛋白沉淀的溫度。
2.?熱蛋白質組學譜（TPP）：全蛋白質組層面的“無偏見”篩選
?簡化原理：結合CETSA與定量質譜，構建數(shù)千個蛋白的熔解曲線，實現(xiàn)未知靶點發(fā)現(xiàn)。
?核心流程：樣品經不同溫度處理→酶解肽段→TMT標記→LC-MS/MS分析→比較報告離子強度。
?核心優(yōu)勢：可發(fā)現(xiàn)直接靶點、脫靶效應及下游通路變化，“一鍋法”策略提升初篩通量，覆蓋＞6000種蛋白。
3.?藥物親和力響應靶點穩(wěn)定性分析（DARTS）：天然產物的首選
?簡化原理：藥物結合增強蛋白對蛋白酶的抗性，通過檢測酶解后存活的蛋白篩選靶點。
?核心優(yōu)勢：無需修飾天然產物，避免修飾導致的活性喪失，實驗門檻低。
?實操要點：嚴格控制酶/蛋白比例（Pronase?1:100-1:300，Thermolysin?1:10）；設置溶劑對照組，檢測內參蛋白排除藥物對蛋白酶活性的抑制。
4.?限制性蛋白酶解-質譜技術（LiP-MS）：結構指紋的解析者
?簡化原理：非特異性蛋白酶短時間酶解蛋白，藥物結合改變酶切位點可及性，通過肽段指紋變化鑒定靶點并定位結合位點。
?核心優(yōu)勢：分辨率達肽段水平，可區(qū)分變構效應，需用FragPipe+FLiPPR軟件處理數(shù)據(jù)。
04?免修飾篩選技術的綜合決策樹
面對如此繁多的技術，研究者該如何抉擇？以下決策樹可供參考：
場景一：已有純化蛋白，需篩選/驗證化合物庫
①?小分子/片段篩選（<150Da）：首選GCI或高靈敏度SPR。GCI在極小分子檢測和快解離動力學上具優(yōu)勢。
②?粗制樣品/高通量初篩：首選BLI。耐受雜質，速度快，成本相對可控。
③?需深度熱力學機制（焓/熵）：唯有ITC。盡管耗樣大，但數(shù)據(jù)維度不可替代。
④?樣品極其珍貴/易聚集：嘗試MST。微量、溶液內檢測，避開表面固定化難題。
場景二：已知表型，需鑒定未知靶點
①?無質譜平臺，主要關注特定候選蛋白：CETSA(Western?Blot)或DARTS。低成本，實驗室通用性強。
②?有質譜支持，需全蛋白質組掃描：TPP(CETSA-MS)。目前最成熟的組學靶點發(fā)現(xiàn)工具，覆蓋度廣（>6000蛋白）。
③?需了解結合位點/關注結構變化：LiP-MS。提供結構分辨率，可區(qū)分變構效應。
④?針對膜蛋白靶點：改進版CETSA（使用非離子去污劑）或GCI（結合Nanodiscs技術）。
前沿展望與結語
隨著人工智能（AI）與多組學技術的深度融合，免修飾篩選正迎來新的變革。機器學習算法已被用于預測LiP-MS中的酶切位點變化，輔助解釋復雜的構象動態(tài)。同時，微流控與類器官技術的結合，使得在更接近人體生理環(huán)境的3D模型中進行免修飾靶點驗證成為可能。
對于廣大生物醫(yī)學研究者而言，沒有一種技術是萬能的?！敖M合拳”策略往往最為有效：例如，先用TPP進行全譜篩選圈定候選列表，再用CETSA/WB進行驗證，最后通過SPR/GCI測定精確動力學，并輔以LiP-MS解析結合模式。這種多維度、互相印證的證據(jù)鏈，將極大提升藥物靶點發(fā)現(xiàn)的成功率，讓您的研究經得起時間的考驗。
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LiP - MS科研buff 加持！藥物靶點研究3大場景輕松破局
? 藥物靶點篩選：在體外生理條件下，尋找小分子藥物可能的作用靶點。
? 藥物 - 蛋白結合域分析：于體外生理條件中，探究純化重組蛋白和目標藥物的作用區(qū)域以及結合位點。
? 藥物機制研究：在體內給藥的條件下，鉆研小分子藥物潛在的作用靶點及其發(fā)揮作用的機制。
參考資料
1.?Cooper?MA.?Optical?biosensors?in?drug?discovery.?Nat?Rev?Drug?Discov.?2002;1(7):515-528.?
2.?Park?H,?Ha?J,?Park?SB.?Label-free?target?identification?in?drug?discovery?via?phenotypic?screening.?Curr?Opin?Chem?Biol.?2019;50:66-72.?
3.?ForteBio?(Molecular?Devices).?Label-free?detection:?technologies,?key?considerations,?and?applications?[Electronic?Resource].?Fremont,?CA:?Molecular?Devices,?LLC;?2019.
4.?Abdiche?Y,?Malashock?D,?Pinkerton?A,?Pons?J.?Determining?kinetics?and?affinities?of?protein?interactions?using?a?parallel?real-time?label-free?biosensor,?the?Octet.?Anal?Biochem.?2008;377(2):209-217.?
5.?Savitski?MM,?Reinhard?FB,?Franken?H,?et?al.?Tracking?cancer?drugs?in?living?cells?by?thermal?profiling?of?the?proteome.?Science.?2014;346(6205):1255784.
6.?Kopec?KK,?Bozyczko-Coyne?D,?Williams?M.?Target?identification?and?validation?in?drug?discovery:?the?role?of?proteomics.?Biochem?Pharmacol.?2005;69(8):1133-1139.?
7.?Feng?Y,?De?Franceschi?G,?Kahraman?A,?et?al.?Global?analysis?of?protein?structural?changes?in?complex?proteomes.?Nat?Biotechnol.?2014;32(10):1036-1044.?
8.?Lomenick?B,?Hao?R,?Jonai?N,?et?al.?Target?identification?using?drug?affinity?responsive?target?stability?(DARTS).?Proc?Natl?Acad?Sci?U?S?A.?2009;106(51):21984-21989.?
